Calpastatin-Calpain系統(tǒng)通過MMP2-TGF-β1通路改善血管再狹窄.pdf

1、目的：以過表達(dá)鈣蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin)的小鼠及血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth mucle cells，VSMCs)為研究對象，評估鈣蛋白酶抑制蛋白/鈣蛋白酶（Calpastatin/Calpain）系統(tǒng)在平滑肌細(xì)胞增殖、遷移、膠原合成及血管再狹窄中的作用，旨在探討Calpastatin/Calpain系統(tǒng)在辛伐他汀(simvastatin)改善PDGF誘導(dǎo)的血管再狹窄過程中的作用。
　　方法：⑴動

2、物實驗：分組:C57BL/6J野生小鼠假手術(shù)組(WT mice)、C57BL/6J野生小鼠模型組(WT ligation mice)、Calpastatin轉(zhuǎn)基因小鼠假手術(shù)組(TG mice)、Calpastatin轉(zhuǎn)基因小鼠模型組(TG ligation mice)；采用結(jié)扎頸動脈分叉處的方法造模；通過HE染色的方法檢測造模后0天、7天、14天、21天、28天勁動脈的內(nèi)膜增生及血管狹窄程度；采用qRT-PCR的方法檢測勁動脈Calpa

3、in-1，Calpain-2，CalpastatinmRNA的表達(dá)情況；模后14天，采用免疫組織化學(xué)的方法檢測增殖細(xì)胞核抗原(ProliferatingCellNuclearAntigen，PCNA)、Ⅰ型膠原纖維(CollagenⅠ)、Calpain-1、Calpain-2、Calpastatin、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1(MT1MMP)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子2(TIMP2)在增生血管中的分布及表達(dá)。⑵細(xì)胞

4、實驗：分組:野生小鼠平滑肌細(xì)胞組(WT)、野生小鼠平滑肌細(xì)胞+PDGF-BB組(WT+PDGF-BB)、野生小鼠平滑肌細(xì)胞+PDGF-BB+辛伐他汀組(WT+PDGF-BB+Simvastatin)、轉(zhuǎn)基因小鼠平滑肌細(xì)胞組(TG)、轉(zhuǎn)基因小鼠平滑肌細(xì)胞+PDGF-BB組(TG+PDGF-BB)、轉(zhuǎn)基因小鼠平滑肌細(xì)胞+PDGF-BB+辛伐他汀組(TG+PDGF-BB+Simvastatin)；用CCK8試劑盒檢測各組干預(yù)條件干預(yù)后血管平滑

5、肌細(xì)胞的增殖能力；分別應(yīng)用Transewell及細(xì)胞劃痕實驗檢測各組干預(yù)條件干預(yù)后血管平滑肌細(xì)胞的定向與非定向遷移能力；采用qRT-PCR的方法檢測各組干預(yù)條件干預(yù)后血管平滑肌細(xì)胞的Calpain-1,Calpain-2,Calpastatin,MMP2,MT1MMP, TIMP2,CollagenⅠ,TGF-β1mRNA的表達(dá)情況；用蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測各組干預(yù)條件干預(yù)后血管平滑肌細(xì)胞相關(guān)蛋白(Cal

6、pain-1，Calpain-2，Calpastatin，MMP2，MT1MMP,TIMP2，TGF-β1)的表達(dá)，通過檢測SBDP(Spectrin breakdown products)的表達(dá)來檢測Calpain的活性。
　　結(jié)果：①血管再狹窄后Calpain-1，Calpain-2的mRNA表達(dá)增加，Calpastatin的mRNA表達(dá)減少。②造模14天后，與假手術(shù)組相比，Calpain-1，Calpain-2，TGF-β1

7、的mRNA表達(dá)增多，而轉(zhuǎn)基因小鼠組較野生小鼠組Calpain-1，TGF-β1的mRNA表達(dá)下降，Calpain-2的表達(dá)變化無統(tǒng)計學(xué)差異，且轉(zhuǎn)基因小鼠組較野生小鼠組PCNA陽性率減低， CollagenⅠ，Calpain-1，Calpain-2，Calpastatin，MMP2，MT1MMP/TIMP2的蛋白表達(dá)減少。③野生小鼠平滑肌+PDGF-BB組較野生小鼠平滑肌細(xì)胞組細(xì)胞增殖、遷移增加，且CollagenⅠ，CollagenⅢ，

8、Calpain-1的mRNA表達(dá)增多，Calpain-1，Calpain-2，MMP2，MT1MMP, TGF-β1的蛋白表達(dá)增多，Calpain的活性增加，而Calpastatin的蛋白表達(dá)減少。轉(zhuǎn)基因小鼠平滑肌細(xì)胞+PDGF-BB組(TG+PDGF-BB)較野生小鼠平滑肌+PDGF-BB組(WT+PDGF-BB)相應(yīng)的都表達(dá)減少，Calpastatin的蛋白表達(dá)增加。④野生小鼠平滑肌+PDGF-BB+辛伐他汀組(WT+PDGF-BB

9、+Simvastatin)較野生小鼠平滑肌+PDGF-BB組(WT+PDGF-BB) Calpastatin的mRNA表達(dá)增加，而Calpain-1，MMP2，TGF-β1，CollagenⅠ，CollagenⅢ的mRNA表達(dá)減少，細(xì)胞增殖、遷移也減輕。轉(zhuǎn)基因小鼠平滑肌細(xì)胞+PDGF-BB+辛伐他汀組(TG+PDGF-BB+Simvastatin)較野生小鼠平滑肌+PDGF-BB+辛伐他汀組（WT+PDGF-BB+Simvastatin

10、)Calpain-1,MMP2,CollagenⅠ的mRNA表達(dá)及細(xì)胞增殖、遷移也減輕。
　　結(jié)論：⑴血管再狹窄的病理過程中，Calpain-1，Calpain-2表達(dá)增加，而Calpastatin表達(dá)減少。⑵過表達(dá)Calpastatin可以使血管再狹窄減輕。⑶Calpastatin/Calpain系統(tǒng)通過MT1MMP/TIMP2的比例來調(diào)節(jié)MMP2及其下游分子TGF-β1。⑷過表達(dá)Calpastatin通過調(diào)節(jié)Calpain-1