子宮內(nèi)膜癌中差異表達(dá)microRNA的篩選及miR-944對(duì)子宮內(nèi)膜癌生物學(xué)行為影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本課題旨在闡明子宮內(nèi)膜癌組織中的miRNA表達(dá)譜及miR-944對(duì)子宮內(nèi)膜癌生物學(xué)行為影響及調(diào)控作用的機(jī)制研究。
　　研究?jī)?nèi)容包括以下四部分:
　　第一部分 子宮內(nèi)膜癌組織中差異表達(dá)miRNA的篩選研究
　　目的:篩選出子宮內(nèi)膜癌組織中的差異表達(dá)的miRNA分子，獲得子宮內(nèi)膜癌miRNA表達(dá)譜，尋找新的診斷標(biāo)志物。
　　方法:收集3例子宮內(nèi)膜癌患者的癌變內(nèi)膜組織和3例正常對(duì)照組子宮內(nèi)膜組織，提取RNA，應(yīng)用丹麥E

2、xiqon公司的miRCURYTM LNA miRNA芯片，篩選出子宮內(nèi)膜癌組織中的差異表達(dá)的miRNA分子，采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)在樣本中進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果:1.3例癌組織和3例正常內(nèi)膜組織的總RNA抽取及質(zhì)檢，結(jié)果顯示，所提取的總RNA的電泳可見(jiàn)帶28s和18s條帶，260/A280的值都介于1.8-2.1之間，檢測(cè)RNA檢測(cè)結(jié)果符合雜交芯片實(shí)驗(yàn)要求。
　　2.miRNA芯片結(jié)果顯示:子宮內(nèi)膜

3、癌組織與正常子宮內(nèi)膜組織存在有顯著差異表達(dá)的miRNA:有14個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，6個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)。
　　3.采用qRT-PCR方法對(duì)上調(diào)的miR-944、miR-373及下調(diào)的miR-548、miR-885進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示:子宮內(nèi)膜癌中miR-944、miR-373上調(diào)的倍數(shù)為3.13倍和4.2倍，miR-548、miR-885下調(diào)倍數(shù)為2.08倍及3.84倍，與芯片結(jié)果比較，趨勢(shì)一致。
　　結(jié)論：miRNA表達(dá)

4、譜芯片可用于分析子宮內(nèi)膜癌組織miRNA表達(dá)譜;通過(guò)miRCURYTMLNA miRNA芯片篩選結(jié)合qRT-PCR驗(yàn)證，共得到14個(gè)顯著上調(diào)6個(gè)顯著下調(diào)的miRNA，為下一步開展子宮內(nèi)膜癌組織miRNA的研究及功能學(xué)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第二部分 子宮內(nèi)膜癌組織中miR-944表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系
　　目的:探討miR-944在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)，并分析其與臨床病理特征的關(guān)系。
　　方法:收集2012年3

5、月-2014年4月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的子宮內(nèi)膜癌患者的癌變內(nèi)膜組織40例，收集同期因子宮肌瘤等良性病變行子宮切除術(shù)的正常子宮內(nèi)膜組織25例作為對(duì)照。采用qRT-PCR方法進(jìn)行miR-944表達(dá)水平的相對(duì)定量檢測(cè)，并分析其與患者臨床病理特征的關(guān)系。
　　結(jié)果:1.miR-944在子宮內(nèi)膜癌組織及正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)子宮內(nèi)膜癌組miR-944的表達(dá)水平高于及正常內(nèi)膜組（P＜0.05）。
　　2.miR-9

6、44與臨床病理特征的關(guān)系
　　miRNA-944的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、病理類型、淋巴轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)深度及FIGO分期因素相關(guān)，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與年齡無(wú)相關(guān)性。
　　結(jié)論:miR-944在子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá)，提示miR-944可能參與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生及發(fā)展;miR-944的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、病理類型、淋巴轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)深度及FIGO分期因素相關(guān)，可能可以預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜癌的惡性程度及不良預(yù)后。
　　第三部分

7、miR-944對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　目的:探討miR-944對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞和KLE細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　方法:人工合成miR-944的模擬物mimics及抑制物inhibitor，利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法，分別轉(zhuǎn)染至人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞和KLE細(xì)胞中。設(shè)置陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組。采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法對(duì)比轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖生長(zhǎng)能力的區(qū)別;流式細(xì)胞

8、學(xué)對(duì)比轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞凋亡情況的區(qū)別;Transwell小室法對(duì)比轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞遷移和侵襲能力的區(qū)別。
　　結(jié)果:1.細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果
　　熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后的miR-944 mimics的轉(zhuǎn)染效率，通過(guò)熒光鏡下視野與光鏡下視野對(duì)比，Ishikawa細(xì)胞和KEL細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率大約為85％。
　　2.miR-944-mimics及miR-944-inhibitor對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞KLE細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。<

9、br>　　(1)CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
　　分別在(24h、48h、72h、96h)四個(gè)時(shí)間點(diǎn)行CCK8檢測(cè)Ishikawa和KLE細(xì)胞的OD值，結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染了miR-944mimics的Ishikawa細(xì)胞和KLE細(xì)胞增殖活性均增強(qiáng)，轉(zhuǎn)染了miR-944inhibitor的 Ishikawa細(xì)胞和KLE細(xì)胞增殖活性均降低(P＜0.05)。
　　(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　對(duì)miR-944

10、轉(zhuǎn)染48h后的Ishikawa細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞凋亡分析，結(jié)果顯示，B組、NC組、miR-944inhibitor組和miR-944mimics組凋亡率分別為0.58±0.06％、0.66±0.07％、11.74±0.19％、0.68±0.03％,miR-944inhibitor組凋亡率明顯高于B組(P＜0.05)，miR-944mimics組凋亡率與B組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。對(duì)miR-944轉(zhuǎn)染48h后的KLE細(xì)胞進(jìn)行

11、流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞凋亡分析，結(jié)果顯示，B組、NC組、miR-944 inhibitor組和miR-944mimics組凋亡率分別為2.55±0.23％、2.53±0.10％、5.13±0.14％、2.99±0.18％，miR-944inhibitor凋亡率明顯高于B組(P＜0.05)，miR-944mimics組凋亡率與B組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(3)細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)
　　檢測(cè)轉(zhuǎn)染48h后各組KLE細(xì)胞遷移能力，對(duì)

12、穿膜細(xì)胞進(jìn)行拍照和計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-944 mimics的KLE細(xì)胞穿膜數(shù)量較B組明顯增多(P＜0.05);轉(zhuǎn)染miR-944 inhibitor的KLE細(xì)胞穿膜數(shù)量較B組明顯減少(P＜0.05)。Ishikawa細(xì)胞過(guò)膜后鋪展性不好，拍照后無(wú)法計(jì)數(shù)，CCK8方法檢測(cè)過(guò)膜細(xì)胞，結(jié)果顯示:相對(duì)于對(duì)照組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染了miR-944 mimics的Ishikawa細(xì)胞OD值高，間接反映了mimics組的穿膜數(shù)量多;轉(zhuǎn)染miR-944i

13、nhibitor的Ishikawa細(xì)胞OD低，間接反映了inhibitor組的穿膜數(shù)量少(P＜0.05)。
　　結(jié)論:miR-944可促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖，侵襲與轉(zhuǎn)移能力，降低miR-944水平可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，表明miR-944可能發(fā)揮癌基因的作用參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展。
　　第四部分 miR-944對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物學(xué)行為調(diào)控的靶基因預(yù)測(cè)及鑒定
　　目的:預(yù)測(cè)并實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-944的靶基因，初步探討miR-

14、944的生物學(xué)機(jī)制。
　　方法:登陸microRNA庫(kù)及靶基因預(yù)測(cè)的網(wǎng)站，在線檢測(cè)或下載靶基因預(yù)測(cè)軟件，綜合運(yùn)用TargetScan(http://genes.mit.edu/targetscan)、Mirbase（http://mirbase.org）、miRanda（http://www.microma.org）生物信息篩選miR-944最可能的靶基因。Westem blot(WB)對(duì)比轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞表達(dá)靶基因的區(qū)別。構(gòu)建最可能

15、的靶基因的3' UTR雙熒光素酶報(bào)告載體，檢測(cè)熒光素的活性以期在基因水平上驗(yàn)證靶基因上存在miR-944的作用靶點(diǎn)。
　　結(jié)果:1.預(yù)測(cè)miR-944的靶基因
　　通過(guò)預(yù)測(cè)軟件miRanda、Mirbase及TargetScan預(yù)測(cè)miR-944的靶基因，三個(gè)軟件交集的miRNA-944靶基因共70個(gè);登陸基因庫(kù)，查詢以上靶基因功能，尤其注意與惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的功能基因。最后選擇非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶14(prot

16、ein tyrosine phosphatase non-receptor type14，PTPN14)作為miR-944的可能靶基因來(lái)進(jìn)一步研究。應(yīng)用Targetscan預(yù)測(cè)miR-944與PTPN14基因的結(jié)合位點(diǎn)。
　　2.蛋白水平驗(yàn)證PTPN14是否為miR-944的靶基因
　　miR-944mimics組的KLE細(xì)胞的PTPN14蛋白表達(dá)量與B組比較下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); miR-944inhib

17、itor組則高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）表明miR-944模擬物能降低KLE細(xì)胞中PTPN14蛋白的表達(dá)，B組與NC組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在Ishikawa細(xì)胞中，miR-944mimics組，miR-944 inhibitor組的PTPN14蛋白表達(dá)量與B組均無(wú)差異(P＞0.05)。
　　3.miR-944與PTPN14的結(jié)合結(jié)合靶點(diǎn)驗(yàn)證
　　將miR-944mimics與連接了PTPN14基因3'-UTR區(qū)的