糖腎方改善C57BLKS-J db-db小鼠脂代謝紊亂的作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、近年來(lái)，肥胖及其密切相關(guān)的代謝性疾病，包括非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)、代謝綜合征(Metabolic syndrome，MS)和2型糖尿病等患病率日益攀升，嚴(yán)重危害全球人類的健康。NAFLD目前被認(rèn)為是全球最普遍的慢性肝臟疾病，其在肥胖和糖尿病人群中的患病率顯著高于健康人群。此外，這些疾病會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、冠心?。–oronary heart disease

2、，CHD）等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。NAFLD最顯著的病理改變?yōu)楦闻K脂質(zhì)尤其是甘油三酯（Triglyceride，TG）異常聚集在肝臟細(xì)胞造成脂毒性損傷肝細(xì)胞，影響肝功能。雖然目前脂質(zhì)沉積的具體機(jī)制存有爭(zhēng)議，但脂質(zhì)生成（脂肪酸從頭合成）、脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和脂肪酸氧化等相關(guān)代謝途徑出現(xiàn)代謝紊亂必然造成肝臟脂質(zhì)沉積。目前，針對(duì)NAFLD的臨床相關(guān)藥物如噻唑烷二酮類藥物和生活方式改善等在療效和安全性上不盡如人意;因此，利用我們的優(yōu)勢(shì)聚焦到開發(fā)中醫(yī)藥改

3、善血脂紊亂及保護(hù)肝臟脂肪變就顯得十分必要。
　　課題組李平教授在繼承前人經(jīng)驗(yàn)和以多年臨床經(jīng)驗(yàn)提出治療糖尿病腎病的重要組方糖腎方，并創(chuàng)新性提出了從肝論治糖尿病腎病理念;前期多中心臨床研究表明其可有效降低24 h尿蛋白和提高腎小球?yàn)V過(guò)率;但其對(duì)于糖尿病伴隨的脂代謝紊亂是否具有改善作用以及具體的分子機(jī)制是什么？基于上述背景知識(shí)，本研究主要利用NAFLD模型C57BLKS/J db/db小鼠，第一部分從整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平觀察糖腎方是否具有改

4、善脂代謝紊亂和保護(hù)肝脂變的作用;在此基礎(chǔ)上，第二部分圍繞脂質(zhì)沉積開展糖腎方作用的具體機(jī)制研究:1）AMPK/SREBPs介導(dǎo)的脂質(zhì)生成途徑;2）AMPK/Sirt1/PGC1α介導(dǎo)的脂肪酸β氧化代謝途徑;3）PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路及糖異生途徑;4）肝臟和白色脂肪組織巨噬細(xì)胞活化分型探索中藥糖腎方顆粒對(duì)db/db小鼠脂質(zhì)代謝紊亂的調(diào)節(jié)尤其是肝臟脂肪變的潛在保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。
　　目的:利用db/db小鼠觀察中藥糖腎方顆

5、粒對(duì)糖尿病伴隨的脂代謝紊亂調(diào)節(jié)和保護(hù)肝臟脂肪變的作用，并圍繞脂質(zhì)沉積這一病理改變深入探討相關(guān)機(jī)制。
　　方法:8周齡雄性db/db和db/m小鼠隨機(jī)分成3組(n=9)，正常對(duì)照組(db/m)、模型組(db/db)、糖腎方組（db/db+TSF,2.4 g/kg/day），所有小鼠均以常規(guī)普通飼料喂養(yǎng)。順應(yīng)性喂養(yǎng)2周后觀察基礎(chǔ)狀態(tài)并稱重，開始給予糖腎方干預(yù)，每周測(cè)量小鼠體重。糖腎方給藥干預(yù)12周后，禁食12h后眼內(nèi)眥取血，全自動(dòng)生化

6、儀檢測(cè)血脂、血糖、血清游離脂肪等項(xiàng)目;處死小鼠，迅速分離小鼠肝臟、骨骼肌及白色脂肪等，用冷磷酸鹽緩沖液洗凈，濾紙吸干水分，稱重記錄，計(jì)算肝重指數(shù);一部分肝組織放入細(xì)胞凍存管中存入液氮備用，另一部分直接存入-80℃用于后續(xù)冰凍切片;其余放入中性福爾馬林溶液固定用于病理分析。骨骼肌及白色脂肪組織立即存入液氮中備用。
　　利用高效液相色譜方法建立的化學(xué)成分指紋譜圖全面評(píng)價(jià)中藥糖腎方顆粒的質(zhì)量;H&E染色及油紅O染色觀察小鼠肝臟脂肪變及糖

7、腎方干預(yù)情況;利用Westernblot、Real-time PCR、IHC、免疫熒光及Confocal技術(shù)檢測(cè)糖腎方對(duì)各組小鼠肝組織中脂質(zhì)生成途徑中pAMPK/SREBPs及下游靶基因表達(dá)的影響;利用以上方法檢測(cè)糖腎方對(duì)各組小鼠肝組織和骨骼肌中脂肪酸β氧化途徑中相關(guān)代謝酶的表達(dá)影響;利用以上方法檢測(cè)糖腎方對(duì)各組小鼠肝組織PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路及糖原合成的影響;利用Real-time-PCR、IHC檢測(cè)糖腎方對(duì)各組小鼠肝臟和

8、白色脂肪組織巨噬細(xì)胞的影響。
　　結(jié)果:1.糖腎方對(duì)db/db小鼠脂代謝調(diào)節(jié)及肝脂變保護(hù)作用:干預(yù)6周后，糖腎方可以顯著減輕db/db小鼠體重;干預(yù)12周即實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，其可顯著減輕db/db小鼠體重、肝重及肝重指數(shù);肝臟形態(tài)學(xué)表明db/m小鼠肝臟形態(tài)正常，色澤紅潤(rùn)，質(zhì)地柔軟。db/db小鼠肝組織體積增大，有明顯腫脹感，色澤土黃，質(zhì)地較硬，表面油膩感較顯著，提示該組小鼠肝臟脂肪變嚴(yán)重，而糖腎方干預(yù)可明顯改善以上病變;糖腎方可以顯著降

9、低小鼠血清中ALT、AST、TG、TC、LDL-C、LDL-C/HDL-C、FFA等因子水平，改善血脂水平和肝功能，但對(duì)血糖水平無(wú)顯著改善;H&E和油紅O染色結(jié)果顯示糖腎方可顯著減少db/db小鼠肝組織脂滴和空泡數(shù)量、改善肝組織結(jié)構(gòu)、減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，油紅O陽(yáng)性著色面積減少。
　　2.糖腎方改善db/db小鼠肝臟脂肪變的可能作用機(jī)制:
　　2.1糖腎方對(duì)db/db小鼠肝組織AMPK/SREBPs及其下游脂肪酸從頭合成靶分子的

10、影響:Western Blot和Confocal結(jié)果顯示糖腎方可顯著上調(diào)pAMPK水平及抑制轉(zhuǎn)錄因子SREBP1的表達(dá)及入核;糖腎方可顯著下調(diào)FAS、SCD1、HMGCR及HMGCS等脂質(zhì)從頭合成途徑(De novo lipogenesis，DNL)和膽固醇合成關(guān)鍵代謝酶的表達(dá)，顯著上調(diào)pACC蛋白水平和AdipoR1/2基因表達(dá)水平;
　　2.2糖腎方對(duì)db/db小鼠肝臟與骨骼肌脂質(zhì)氧化途徑的影響:糖腎方可顯著增加db/db小鼠

11、肝臟脂質(zhì)氧化關(guān)鍵分子Sirt1、PGC1、PPARα、 MLYCD和CPT1A等基因及蛋白表達(dá);糖腎方可以顯著上調(diào)脂質(zhì)氧化相關(guān)基因Acox1、Acadm等表達(dá)，同時(shí)減少LXRα和LOX1的表達(dá);免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示了糖腎方可以降低db/db小鼠肝組織FAS、CPT1A和MLYCD的表達(dá);糖腎方同時(shí)可顯著增加db/db小鼠骨骼肌pAMPK、Sirt1、PGC1α和MLYCD的蛋白表達(dá)水平;與此同時(shí)上調(diào)CPT1B、Acadm基因表達(dá)和下調(diào)

12、Ucp2/3基因表達(dá);糖腎方可降低db/db小鼠肝組織TG水解和FFA轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因LPL和FAT/CD36的表達(dá)水平，降低肝組織FFA和TG濃度;此外，糖腎方可顯著增加db/db小鼠骨骼肌中線粒體生物合成基因Tfam和Esrra的表達(dá)水平;
　　2.3糖腎方對(duì)db/db小鼠肝組織PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路及巨噬細(xì)胞活化的影響:糖腎方可顯著增加db/db小鼠肝組織PI3K/Akt蛋白水平和減少pmTOR水平，提示可以改善肝組

13、織胰島素抵抗與mTOR介導(dǎo)的脂質(zhì)沉積;與此同時(shí)糖腎方可顯著增加db/db小鼠肝組織糖原合成水平并下調(diào)糖異生途徑中Pck1、G6pc基因表達(dá)及上調(diào)GK基因表達(dá);糖腎方可顯著下調(diào)db/db小鼠肝臟和白色脂肪組織巨噬細(xì)胞活化標(biāo)記物CD68和F4/80基因表達(dá)水平;進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)糖腎方可顯著下調(diào)白色脂肪組織M1標(biāo)記物TNFα及Ccl2、Ucp2基因水平，但對(duì)M2標(biāo)記物Mrc1和Arg1無(wú)顯著作用。
　　結(jié)論:糖腎方可降低db/db小鼠體重及肝