煙粉虱被球孢白僵菌侵染后免疫應(yīng)答相關(guān)基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、煙粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)是一種世界性分布的重要害蟲。球孢白僵菌Beauveriabassiana(Bals.) Vuill作為一種重要的蟲生真菌，能通過侵染使煙粉虱致死，同時(shí)，被其侵染的煙粉虱常常通過免疫反應(yīng)來抵御其侵染進(jìn)程。昆蟲對(duì)蟲生真菌的免疫能力直接影向其侵染效率，這一直是以菌治蟲領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本文鑒定了煙粉虱體內(nèi)參與免疫反應(yīng)的β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白(β-1，3-glucan recogniti

2、on proteins of B.tabaci，BtβGRPs)、絲氨酸蛋白酶(serine protease of B.tabaci，BtCLIPs)和溶茵酶(lysozyme of B.tabaci，BtLyzs)基因，根據(jù)其編碼的氨基酸序列，與其它物種的同源蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析;通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)了被球孢白僵菌侵染后，煙粉虱體內(nèi)基因的時(shí)間表達(dá)模式;

3、并對(duì)BtβGRPs基因原核表達(dá)及純化獲得目的蛋白以制備抗體。本研究為探索煙粉虱生防的新靶標(biāo)，增強(qiáng)球孢白僵菌在煙粉虱IPM體系中的作用奠定基礎(chǔ)。全文的主要結(jié)果與結(jié)論如下:
　　1.煙粉虱模式識(shí)別受體βGRPs的先天免疫應(yīng)答
　　為探索BtβGRP在煙粉虱先天免疫過程中的重要作用，對(duì)煙粉虱中鑒定的3個(gè)BtβGRPs基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，并與其它物種的23個(gè)同源蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，同時(shí)通過qRT-PCR檢測(cè)分析球孢白

4、僵菌侵染煙粉虱不同蟲態(tài)不同時(shí)間點(diǎn)后BtβGRPs的時(shí)間表達(dá)模式。結(jié)果顯示:經(jīng)鑒定3個(gè)BtβGRPs蛋白序列均含有βGRP家族特有的保守性結(jié)構(gòu)域，即糖苷水解酶活性結(jié)構(gòu)域;且3個(gè)BtβGRPs獨(dú)自聚在進(jìn)化樹的一支上，可能參與煙粉虱特有的級(jí)聯(lián)路徑;3個(gè)BtβGRPs基因在不同蟲態(tài)和不同誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照相比，除BtβGRP3在卵期未表達(dá)外，均有上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，但誘導(dǎo)程度不同;成蟲誘導(dǎo)24～36 h后達(dá)到峰值，比卵和若蟲稍晚，可能是由于煙粉虱成蟲體

5、表有白色蠟粉等物質(zhì)，延遲了球孢白僵菌對(duì)蟲體的侵染。
　　2.煙粉虱clip絲氨酸蛋白酶基因鑒定與分析
　　為了解參與煙粉虱免疫反應(yīng)的clip絲氨酸蛋白酶(clip-domain serine proteases in B.tabaci，BtCLIPs)基因，對(duì)已鑒定的8個(gè)BtCLIPs基因編碼的蛋白進(jìn)行序列分析，與岡比亞按蚊、家蠶、黑腹果蠅、煙草天蛾4種模式昆蟲的同源蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，并通過qRT-PCR檢測(cè)球孢白僵菌侵

6、染煙粉虱4齡若蟲后BtCLIPs的時(shí)間表達(dá)模式。結(jié)果顯示，8個(gè)BtCLIPs基因均為含有CLIPs結(jié)構(gòu)域的絲氨酸蛋白酶基因;BtCLIP19、BtCLIP20和BtCLIP21獨(dú)自聚在進(jìn)化樹的一支上;其它BtCLIPs均與4種模式昆蟲中的1種或多種同源蛋白聚在一起;與對(duì)照相比，8個(gè)BtCLIPs基因受球孢白僵菌侵染后在不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量均上調(diào)，但誘導(dǎo)程度不同，48 h的相對(duì)表達(dá)量達(dá)最高，其中BtCLIP19上調(diào)表達(dá)最明顯，為對(duì)照組的

7、71倍。
　　3.煙粉虱溶菌酶基因的鑒定及表達(dá)分析
　　鑒定出煙粉虱4個(gè)溶菌酶基因，分別命名為BtLyz1、BtLyz2、BtLyz3和BtLyz4，基因序列全長(zhǎng)分別為1819、1149、829和928 nt，分別編碼159、160、148和160個(gè)氨基酸，且均含有信號(hào)肽。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析、氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，BtLyz1和BtLyz4屬于i型溶菌酶，BtLyz2和BtLyz3屬于c型溶菌酶。BtLyz-1與豌豆

8、長(zhǎng)管蚜ApLyz-i1位于同一進(jìn)化支上，BtLyz4與柑橘木虱DcLyz-i3和豌豆長(zhǎng)管蚜ApLyz-i2位于同一進(jìn)化支上。BtLyz2和BtLyz3與褐飛虱NlLyz-c1和異色瓢蟲HaLyz-c3位于同一進(jìn)化支上。與對(duì)照相比，卵期4個(gè)溶菌酶基因和若蟲期BtLyz4的相對(duì)表達(dá)量沒有顯著變化;若蟲期BtLyz1的相對(duì)表達(dá)量先上調(diào)再下調(diào)，而后又有所上調(diào)的波動(dòng)趨勢(shì)，24 h時(shí)上調(diào)表達(dá)最明顯，為對(duì)照組的4.55倍;成蟲期BtLyz1和BtLy

9、z4的相對(duì)表達(dá)量均為先上調(diào)再下調(diào)，而后又有所上調(diào)的波動(dòng)趨勢(shì)，60 h時(shí)上調(diào)表達(dá)最明顯，為對(duì)照組的11.31和4.21倍;若蟲期BtLyz2和BtLyz3的相對(duì)表達(dá)量均為先上調(diào)再下調(diào)表達(dá)，在誘導(dǎo)24 h時(shí)上調(diào)表達(dá)最明顯，為對(duì)照組的5.09和8.31倍，而后急劇下調(diào)，在60 h時(shí)下調(diào)表達(dá)最明顯，為對(duì)照組的0.19和0.13倍;成蟲期BtLyz2和BtLyz3的相對(duì)表達(dá)量均為先上調(diào)再下調(diào)的表達(dá)趨勢(shì)，在24 h時(shí)上調(diào)最明顯，為對(duì)照組的5.56和

10、8.84倍。從煙粉虱體內(nèi)鑒定了4個(gè)溶菌酶基因序列，其中2個(gè)為c型溶菌酶序列，2個(gè)為i型溶菌酶序列;在球孢白僵菌侵染煙粉虱不同蟲態(tài)、不同時(shí)間后，卵期的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照相比沒有顯著變化;在若蟲和成蟲期，不同BtLyzs表現(xiàn)出不同的表達(dá)趨勢(shì)。
　　4.煙粉虱模式識(shí)別受體βGRPs的原核表達(dá)與純化
　　利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，擴(kuò)增得到BtβGRP1和BtβGRP2的完整開放閱讀框(ORF)。其中BtβGRP1的ORF為837bp，編碼278

11、個(gè)氨基酸;BtβGRP2的ORF為531bp，編碼176個(gè)氨基酸。成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)/BtβGRP1和pET-32b(+)/BtβGRP2，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)pET-30a(+)/BtβGRP1和pET-32b(+)/BtβGRP2在IPTG不同濃度和不同誘導(dǎo)時(shí)間下，誘導(dǎo)表達(dá)量基本不變，且兩種目的蛋白都是在包涵體中大量表達(dá)而在上清中表達(dá)量極少。選擇0.2mmol/L的IPTG誘