人工合成β寡糖調(diào)控天然免疫應(yīng)答分子機(jī)制的研究.pdf

1、蘑菇和靈芝等作為食物和藥物在中國應(yīng)用已久，中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)將其應(yīng)用于疾病的預(yù)防和治療。目前研究發(fā)現(xiàn)從不同機(jī)體如細(xì)菌、真菌、植物和其他的有機(jī)體提取的多糖具有良好的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，它能夠與宿主細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表面的選擇性受體（如dectin-1）相互作用，從而激活巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的功能產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答。在香菇和靈芝等的提取物中發(fā)現(xiàn)了很多活性物質(zhì)，具有廣泛生物學(xué)功能，香菇多糖就是其中一種重要的生物活性物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)活性和抗腫瘤活

2、性，能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的功能。香菇多糖通過上調(diào)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞MHC分子和協(xié)同刺激分子的表達(dá)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的成熟和活化從而發(fā)揮抗原遞呈功能，同時(shí)也能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞和DC分泌細(xì)胞因子，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用和抗腫瘤作用。多糖和寡糖在抗炎癥反應(yīng)和抗自身免疫性疾病方面也有很多的報(bào)道，研究發(fā)現(xiàn)多糖具有抗炎作用，抑制炎癥因子表達(dá)，促進(jìn)抗炎因子表達(dá)等作用，并且能夠保護(hù)機(jī)體免受免疫反應(yīng)造成的損傷。鑒于多糖和寡糖的廣泛生物學(xué)功能和免

3、疫調(diào)節(jié)作用，其在藥物設(shè)計(jì)和疫苗研究方面多有應(yīng)用。
　　目前報(bào)道發(fā)現(xiàn)香菇多糖發(fā)揮抗腫瘤活性與其結(jié)構(gòu)和分子量相關(guān)，香菇多糖主鏈形成三螺旋構(gòu)象對于其發(fā)揮生物學(xué)功能具有重要的作用，以β-(1→6)連接為主鏈，β-(1→3)連接為側(cè)鏈的β寡糖是香菇多糖的一個(gè)基本結(jié)構(gòu)單位，被認(rèn)為是香菇多糖發(fā)揮抗腫瘤作用的重要結(jié)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)人工合成的以β-(1→6)連接為側(cè)鏈，β-(1→3)連接為主鏈的β寡糖及其主鏈含有α-(1→3)連接的β寡糖類似物具有和

4、天然提取的香菇多糖相似的抗腫瘤作用，能夠促進(jìn)脾細(xì)胞的增殖和腫瘤壞死因子(TNF-α)的分泌。由于目前應(yīng)用的大部分多糖都是植物或動(dòng)物以及其他物種的提取物，存在結(jié)構(gòu)不確定性，純度不高以及產(chǎn)量較少的問題，而實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)合成的多糖基本結(jié)構(gòu)單位和多糖具有相似的生物學(xué)效應(yīng)，而且人工合成的寡糖具有結(jié)構(gòu)明確，純度高和產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，因此人們基于這些多糖的基本結(jié)構(gòu)單位人工合成寡糖并觀察其生物學(xué)功能。
　　在本實(shí)驗(yàn)中，顧建新教授課題組基于香菇多糖和其他β多

5、糖的基本結(jié)構(gòu)，人工合成了主鏈包含有一個(gè)α-(1→3)連接的，以β-(1→6)連接為側(cè)鏈，β-(1→3)連接為主鏈的六聚體β寡糖，我們研究了人工合成β寡糖對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞成熟活化及其細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié);以HT29細(xì)胞，人外周血單個(gè)核細(xì)胞和單核細(xì)胞為模型，初步探討了人工合成β寡糖對人源免疫細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的機(jī)制;并觀察了人工合成β寡糖對樹突狀細(xì)胞成熟活化及其細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)。
　　一.人工合成β寡糖對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞成熟活化及其細(xì)胞因

6、子表達(dá)的調(diào)節(jié)
　　1.人工合成β寡糖對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞表面分子和炎癥相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響
　　人工合成β寡糖處理小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，F(xiàn)ACS檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面受體CD40表達(dá)上調(diào)，而CD86及MHC(Ⅰ)，(Ⅱ)分子沒有明顯變化。CD40是重要的協(xié)同刺激分子，在激活T細(xì)胞的免疫應(yīng)答方面起著重要的作用，提示β寡糖有利于巨噬細(xì)胞發(fā)揮其抗原呈遞功能。
　　用Real-Time PCR檢測寡糖處理細(xì)胞后炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平

7、，發(fā)現(xiàn)IL-12，IL-6的表達(dá)有不同程度的上調(diào)（未處理組的2.5-2.7倍），而IL-10表達(dá)下調(diào)（未處理組的1/5）。ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清發(fā)現(xiàn)，TNF-α，IL-6和IL-12分泌增加，IL-10分泌減少。TNF-α是抗感染和炎癥反應(yīng)中巨噬細(xì)胞的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子，而且在抗腫瘤方面具有重要的作用。IL-12是重要的T細(xì)胞活化因子，能夠刺激T細(xì)胞和NK細(xì)胞生成IFN-γ和TNF-α，并且減少IL-4介導(dǎo)的IFN-γ的抑制。IL-1

8、0是重要的抗炎因子，在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能方面起著重要作用，主要由Th2類免疫細(xì)胞分泌，它能夠抑制巨噬細(xì)胞的功能。這些結(jié)果提示人工合成β寡糖能夠通過調(diào)節(jié)炎癥因子和抑炎因子的分泌調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能。
　　為了進(jìn)一步研究人工合成β寡糖對小鼠巨噬細(xì)胞分泌免疫調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子的影響，我們用Mouse Cytokine Array Panel A檢測了調(diào)節(jié)細(xì)胞間相互作用的趨化因子及細(xì)胞因子等細(xì)胞外信號分子。結(jié)果顯示，β寡糖對CCL1，CCL2

9、，CCL3，CCL4, CCL5, CCL12, CXCL10, TIMP-1, G-CSF, KC, CD54, MIP-2, IL-1α,IL-1β，IL-6，IL-16，IL-17，IL-23，IL-1ra，IFN-γ和TNF-α的分泌有明顯的促進(jìn)作用。
　　為探討人工合成β寡糖在發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能時(shí)的作用機(jī)制，我們用β寡糖處理小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，定量PCR芯片技術(shù)檢測與炎癥及自身免疫相關(guān)細(xì)胞因子，發(fā)現(xiàn)β寡糖處理前后部分趨化因子

10、及其受體、部分白介素家族成員及其受體等基因表達(dá)有差異，其中有38個(gè)細(xì)胞因子的變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（上調(diào)18個(gè)，下調(diào)20個(gè)）。進(jìn)一步分析與這些細(xì)胞因子表達(dá)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，找到39個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其中7個(gè)是MAPK信號通路上的重要因子，與MAPK信號通路的活化有密切關(guān)系。同時(shí)，分析這7個(gè)轉(zhuǎn)錄因子所對應(yīng)的與炎癥及自身免疫相關(guān)細(xì)胞因子，我們發(fā)現(xiàn)了以下幾個(gè)重要的細(xì)胞因子:Tnfsf14，其主要作用是促進(jìn)T細(xì)胞增殖，觸發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡;Nos2，誘導(dǎo)型

11、一氧化氮合酶，在抗微生物和抗腫瘤反應(yīng)中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用;CCR6，在炎癥反應(yīng)時(shí)調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞的遷移與募集。
　　2.人工合成β寡糖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用相關(guān)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究
　　Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)，人工合成β寡糖能夠增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞MAPK通路上關(guān)鍵蛋白ERK的磷酸化水平，對其上游活化因子c-Raf的磷酸化也有上調(diào)作用。當(dāng)巨噬細(xì)胞ERK磷酸化被抑制時(shí)，β寡糖對巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)也消失;當(dāng)

12、β寡糖促進(jìn)巨噬細(xì)胞ERK磷酸化的作用恢復(fù)后，可以觀察到其對細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。通過檢測PI3K/AKT通路上關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)人工合成β寡糖抑制了AKT蛋白Thr308位點(diǎn)和Ser473位點(diǎn)的磷酸化。同時(shí)，寡糖上調(diào)AKT信號通路上游抑制因子PTEN磷酸化和受AKT磷酸化負(fù)調(diào)控的GSK-3β的磷酸化，并且下調(diào)AKT信號通路上游活化因子PDK-1的磷酸化。
　　3.人工合成β寡糖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用相關(guān)受體和信號通路的研究

13、　　分別用TLR-2，TLR-4和Dectin-1的抗體預(yù)處理小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，然后用人工合成β寡糖處理細(xì)胞，Western Blot分別檢測MAPK和PI3K/AKT信號通路上關(guān)鍵蛋白磷酸化水平，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)寡糖對ERK磷酸化上調(diào)作用與TLR-2和Dectin-1受體相關(guān)，而對AKT蛋白磷酸化的抑制只與Dectin-1受體相關(guān)。ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的分泌，發(fā)現(xiàn)當(dāng)TLR2被阻斷后，用β寡糖處理的細(xì)胞上清中TNF-α和IL-6

14、分泌量比未處理組的量明顯減少，IL-10的分泌量明顯增加。TLR-4被阻斷后，用寡糖處理的細(xì)胞上清中TNF-α，IL-12和IL-10的分泌量與未處理組相比沒有明顯變化，IL-6分泌量則明顯減少。當(dāng)Dectin-1受體被阻斷后，用β寡糖處理的細(xì)胞的上清中TNF-α和IL-12分泌量比未處理組的量明顯減少。結(jié)果提示實(shí)驗(yàn)中使用的人工合成β寡糖對巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響有可能和TLR2，TLR4和Dectin-1受體有關(guān)。
　　二.人

15、工合成β寡糖對人單核細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)調(diào)節(jié)及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響
　　IL-18是IL1細(xì)胞因子超家族中的一員，是IFN-γ產(chǎn)生的主要誘導(dǎo)因子之一，在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)中起著重要作用，能夠調(diào)節(jié)天然免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答，而且也是一個(gè)能夠在不同的免疫環(huán)境中調(diào)節(jié)Th1或Th2類免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子。除了這些作用以外，IL18也參與到慢性炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病當(dāng)中。
　　β寡糖分別處理HT29細(xì)胞和人單核細(xì)胞，通過Real-time

16、 PCR檢測IL-18、IL-18BP、TIR8等細(xì)胞因子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在HT29細(xì)胞和人單核細(xì)胞中，β寡糖能夠能夠增強(qiáng)IL-18BP的表達(dá)，并提高IL-18BP/IL-18的比例。文獻(xiàn)報(bào)道過量表達(dá)TIR8能夠抑制IL-18作用，我們的研究中卻發(fā)現(xiàn)β寡糖對人單核細(xì)胞表達(dá)TIR8起抑制作用。
　　為進(jìn)一步證實(shí)人工合成β寡糖對人PBMC/PBM細(xì)胞間相互作用的趨化因子及細(xì)胞因子等細(xì)胞外信號分子的調(diào)節(jié)作用，我們用Human Cytokin

17、e Array Panel A檢測了細(xì)胞培養(yǎng)上清中趨化因子及細(xì)胞因子的分泌情況。結(jié)果顯示在PBMC中，寡糖能夠促進(jìn)CCL5，CXCL1，MCP-1，MIF，MIP-lalpha和IL-6的分泌。在單核細(xì)胞中，經(jīng)β寡糖處理后，趨化因子CCL5，CXCL1，MCP-1，MIF，MIP-1α，IL-8分泌增加;細(xì)胞因子IL-6，TNF-α和IL-1ra分泌增加。
　　為進(jìn)一步研究人工合成β寡糖在發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能時(shí)的作用機(jī)制，我們用β寡糖

18、處理健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，定量PCR芯片技術(shù)檢測與炎癥及自身免疫相關(guān)細(xì)胞因子，發(fā)現(xiàn)β寡糖處理前后部分趨化因子及其受體、部分白介素家族成員及其受體等基因表達(dá)有差異，其中有22個(gè)細(xì)胞因子的變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（上調(diào)17個(gè)，下調(diào)5個(gè)）。進(jìn)一步分析與這些細(xì)胞因子表達(dá)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，找到38個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其中7個(gè)是MAPK信號通路上的重要因子，與MAPK信號通路有密切關(guān)系。同時(shí)，分析這7個(gè)轉(zhuǎn)錄因子所對應(yīng)與炎癥及自身免疫相關(guān)細(xì)胞因子，

19、我們發(fā)現(xiàn)了以下幾個(gè)重要的細(xì)胞因子:NFATC3(Nuclear factor of activatedT-cells，cytoplasmic3)，其主要作用是調(diào)節(jié)T細(xì)胞基因表達(dá);SYK（脾酪氨酸激酶）潛在的腫瘤抑制因子;SCYE1，細(xì)胞凋亡時(shí)表達(dá)，能促進(jìn)腫瘤壞死因子發(fā)揮作用。β寡糖對于這幾個(gè)細(xì)胞因子的表達(dá)都具有促進(jìn)作用。在人工合成β寡糖對人PBMC活化相關(guān)信號通路的研究中，我們發(fā)現(xiàn)β寡糖作用早期（2-4小時(shí)），細(xì)胞中ERK的磷酸化增強(qiáng)。

20、同時(shí)，人工合成β寡糖能夠促進(jìn)人單核細(xì)胞ERK磷酸化，并且抑制PI3K/AKT通路上AKT蛋白的磷酸化。
　　三.人工合成β寡糖對樹突狀細(xì)胞成熟活化及其細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)
　　鑒于樹突狀細(xì)胞在天然免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答中的重要作用，本實(shí)驗(yàn)觀察以骨髓來源的DC作為細(xì)胞模型觀察β寡糖的免疫調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道分離骨髓細(xì)胞，并在細(xì)胞因子IL-4和GM-CSF作用下分化為樹突狀細(xì)胞(MDC)，通過體外細(xì)胞模型觀察人工合成β寡糖

21、對DC細(xì)胞功能的影響。β寡糖100μg/ml處理小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞24小時(shí)，細(xì)胞表面的CD40表達(dá)指數(shù)為136.1（未處理組為123.4）;CD86表達(dá)指數(shù)為30.1（未處理組為20.6）;MHCⅠ表達(dá)指數(shù)為110.1（未處理組為60.6），MHCⅡ表達(dá)指數(shù)為8.1（未處理組為3.42）。人工合成β寡糖100μg/ml處理小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞4小時(shí)，與未加β寡糖組相比，DC細(xì)胞TNF-α和IL-12轉(zhuǎn)錄水平提高，IL-10轉(zhuǎn)錄水平

22、降低;β寡糖處理DC細(xì)胞48小時(shí)，與未加β寡糖組相比，細(xì)胞上清中TNF-α和IL-6分泌量增加，IL-10分泌量減少，提示β寡糖能夠增強(qiáng)骨髓來源的DC成熟活化并調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)。觀察人工合成β寡糖調(diào)節(jié)DC細(xì)胞功能可能涉及的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)現(xiàn)，β寡糖能夠增強(qiáng)DC細(xì)胞ERK磷酸化水平，對AKT的活化有抑制作用。
　　前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)β寡糖能夠增強(qiáng)乙肝病毒核心抗原前144個(gè)氨基酸的質(zhì)粒DNA(pB144)疫苗誘導(dǎo)的病毒特異性免疫應(yīng)答，本