B10對(duì)(1,3)-β-D-葡聚糖所致肺部炎癥Th免疫應(yīng)答調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　在工農(nóng)業(yè)操作環(huán)境中存在的有機(jī)粉塵種類(lèi)復(fù)雜，包括動(dòng)植物本身具有的各種成分，而且經(jīng)常夾雜一些包括真菌、細(xì)菌在內(nèi)的微生物源性的多重致病性物質(zhì)，其中高濃度真菌污染較為常見(jiàn)。吸入被真菌、細(xì)菌或者動(dòng)物蛋白等污染的有機(jī)粉塵而引起的以肺組織間質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)和肉芽腫形成為基本病理改變特征的疾病，稱(chēng)為職業(yè)性變態(tài)反應(yīng)性肺泡炎。真菌細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分中包含(1，3)-β-D-葡聚糖，是公認(rèn)的職業(yè)環(huán)境中真菌暴露的生物標(biāo)志物。
　　我們前期的

2、研究結(jié)果表明，由于(1，3)-β-D-Glucan暴露引起的變態(tài)反應(yīng)性肺泡炎模型中，存在下列免疫應(yīng)答進(jìn)程:(1)輔助性T細(xì)胞免疫應(yīng)答參與(1，3)-β-D-Glucan暴露引起的小鼠變態(tài)反應(yīng)性肺泡炎的進(jìn)展過(guò)程，其免疫應(yīng)答的效應(yīng)進(jìn)程依賴(lài)于Th1-Th2的有序轉(zhuǎn)化，即Th1型免疫應(yīng)答向Th2型免疫應(yīng)答的協(xié)調(diào)平衡轉(zhuǎn)換;(2)Th1/Th2型免疫應(yīng)答的轉(zhuǎn)換和效應(yīng)強(qiáng)度可影響變態(tài)反應(yīng)性肺泡炎的病理結(jié)局。
　　B10細(xì)胞作為調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(Bre

3、g)的一類(lèi)功能性亞群，主要通過(guò)分泌IL-10發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。IL-10可以抑制巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞活化及分泌促炎細(xì)胞因子，抑制CD4+T細(xì)胞增殖及分泌IFN-γ、TNF-α，進(jìn)而抑制Th1和Th17細(xì)胞分化。與嵌合野生型小鼠相比，IL-10-/-小鼠所患關(guān)節(jié)炎更嚴(yán)重，Treg數(shù)量及Foxp3表達(dá)明顯降低，Th1和Th17細(xì)胞水平顯著提高。這進(jìn)一步證實(shí)，IL-10可能協(xié)同其它的免疫細(xì)胞及Treg，抑制CD4+T淋巴細(xì)胞向Th1和Th17

4、方向分化發(fā)育，進(jìn)而發(fā)揮負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用。
　　我們擬利用(1，3)-β-D-Glucan所致小鼠肺部炎癥模型，通過(guò)建立B10消除小鼠，研究B10對(duì)(1，3)-β-D-Glucan所致肺部炎癥特征及病理過(guò)程動(dòng)態(tài)發(fā)展的影響，分析B10對(duì)肺部炎癥免疫應(yīng)答的調(diào)控作用機(jī)制。旨在為職業(yè)性免疫性肺疾病的預(yù)防和控制提供新的理論依據(jù)。
　　方法:
　　一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組
　　C57BL/6小鼠，雌性，6-8周齡，按體重隨機(jī)分為4組

5、:B10消除葡聚糖組、葡聚糖組、B10消除生理鹽水組、生理鹽水組。B10消除組小鼠腹腔注射抗CD22單克隆抗體，以消除小鼠體內(nèi)B10。葡聚糖組小鼠非暴露氣管灌注葡聚糖，建立肺部炎癥模型。生理鹽水組小鼠灌注等體積生理鹽水。
　　二、H&E染色觀察(1，3)-β-D-Glucan所致肺部炎癥病理過(guò)程及特征
　　病理切片H&E染色動(dòng)態(tài)觀察(1，3)-β-D-glucan所致肺部炎癥病理過(guò)程及特征。
　　三、采用Giemsa染

6、色方法對(duì)BALF中細(xì)胞進(jìn)行染色、計(jì)數(shù)
　　采用Giemsa染色方法對(duì)BALF中細(xì)胞進(jìn)行染色，分別計(jì)數(shù)BALF中中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞。
　　四、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th1/Th17/Treg/B10型細(xì)胞水平
　　取肺門(mén)淋巴結(jié)和脾細(xì)胞懸液，先進(jìn)行表面染色，破膜，再進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，檢測(cè)Th1/Th17/Treg/B10型細(xì)胞數(shù)量。
　　五、Realtime-PCR檢測(cè)Th1/Th17/Th2/Treg型

7、細(xì)胞因子的基因表達(dá)水平
　　Realtime-PCR檢測(cè)肺組織細(xì)胞因子IFN-γ、IL-13、IL-23、IL-10、CTLA-4和特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet、RORγt、GATA3和Foxp3 mRNA的表達(dá)水平。
　　六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　全部數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析比較各組間的統(tǒng)計(jì)差異，當(dāng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，用SNK法進(jìn)行組間比較。
　　結(jié)果:
　　一、B10細(xì)胞參

8、與(1，3)-β-D-glucan所致肺部炎癥病理過(guò)程
　　葡聚糖灌入后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，B10消除葡聚糖組小鼠淋巴結(jié)組織和脾組織中，B10細(xì)胞數(shù)量都低于葡聚糖組，并且在第1天和第21天都顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　二、B10細(xì)胞消除加重(1，3)-β-D-glucan所致肺部炎癥
　　與葡聚糖組相比，B10消除葡聚糖組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)目早期階段升高，而淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)目在中晚期階段升高。

9、r>　　H&E染色結(jié)果顯示，與葡聚糖組小鼠相比，B10消除葡聚糖組小鼠炎癥較重并且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。
　　三、B10細(xì)胞對(duì)(1，3)-β-D-glucan所致肺部炎癥的調(diào)節(jié)效應(yīng)與Th免疫應(yīng)答相關(guān)
　　B10消除葡聚糖組的Th1型細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet和細(xì)胞因子IFN-γ在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都高于葡聚糖組。與葡聚糖組相比，B10消除葡聚糖組小鼠Th2型細(xì)胞因子IL-13和Th2型細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA3的表達(dá)顯著升高。與葡聚糖組小

10、鼠相比，B10消除葡聚糖組小鼠Th1細(xì)胞數(shù)量在第1天和7天升高，21天后又顯著下降。
　　與葡聚糖組小鼠比較，B10消除葡聚糖組小鼠Th17細(xì)胞數(shù)量在第7天有所升高，而1、21天無(wú)明顯變化。在Th17細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt的表達(dá)也出現(xiàn)類(lèi)似結(jié)果。
　　四、B10細(xì)胞通過(guò)影響Treg細(xì)胞調(diào)節(jié)Th免疫應(yīng)答
　　PCR結(jié)果顯示，小鼠灌入葡聚糖后能顯著增加肺組織IL-10、Foxp3及CTLA-4的表達(dá)，而B(niǎo)10細(xì)胞消除

11、后，肺組織IL-10、Foxp3及CTLA-4的表達(dá)顯著下降。與葡聚糖組比較，B10消除葡聚糖組淋巴結(jié)CD4+Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量顯著下降。
　　結(jié)論:
　　1、B10消除加重(1，3)-β-D-Glucan所致小鼠肺部炎癥。
　　2、B10細(xì)胞可抑制Th1/Th17/Th2免疫應(yīng)答，發(fā)揮對(duì)(1，3)-β-D-Glucan所致小鼠肺部炎癥的調(diào)控作用。
　　3、B10細(xì)胞可通過(guò)影響Treg調(diào)控Th免疫應(yīng)答，進(jìn)而抑