人類胚胎生殖細胞（EG）的分離及體外培養(yǎng).pdf

1、人類胚胎多能性干細胞主要來源于附植前胚胎內(nèi)細胞團(ICM)細胞和附植后早期胚胎的原始生殖細胞(PGCs)，是這兩種細胞在體外經(jīng)長期抑制分化培養(yǎng)而獲得的，分別稱為人類胚胎干(ES)細胞和人類胚胎生殖(EG)細胞。這兩種細胞都具有體外無限增殖和分化為體內(nèi)任意三個胚層細胞類型的潛能。 本文主要對人類EG細胞分離及體外培養(yǎng)的體系進行優(yōu)化。雖然自1998年Shamblott等首次報道獲得人類EG細胞系以來，已經(jīng)有4個實驗室報道了人類EG

2、細胞的建系成功，但是這些培養(yǎng)體系都存在諸如建系效率低，自發(fā)分化嚴重和動物源性物質(zhì)污染等一些問題，有待進一步優(yōu)化。 為了增加這個體系的穩(wěn)定性，建系效率以及未來人類的臨床應(yīng)用的安全性，本實驗建立了人源的飼養(yǎng)層體系，對影響人類EG細胞建系的幾個最主要因素如分離培養(yǎng)方法、細胞因子、飼養(yǎng)層、血清、胎齡等進行了實驗分析，并對人類EG細胞在無異源污染的培養(yǎng)體系中的增殖進行了實驗分析。 1.人源飼養(yǎng)層體系的建立 建立了人類

3、皮膚成纖維細胞(hSF)的分離、體外培養(yǎng)、凍存復(fù)蘇及飼養(yǎng)層制作體系。分別從3個5-8月齡胎兒皮膚建立了3個hSF細胞株。凍存復(fù)蘇及體外傳15代后細胞活力和細胞形態(tài)均無明顯變化。 2.分離培養(yǎng)方法、細胞因子、血清、飼養(yǎng)層及胎齡對人類EG細胞體外增殖的影響 使用不同的原代細胞分散方法，結(jié)果顯示消化后輕微吹打能夠在原代獲得更高的集落形成率。 使用含LIF和/或bFGF的培養(yǎng)基培養(yǎng)人類EG細胞，結(jié)果顯示LIF對人類

4、EG細胞體外增殖必需，LIF和bFGF協(xié)同發(fā)揮作用。 使用hSF、mEF和FBS、KSR的不同組合培養(yǎng)人類EG細胞，結(jié)果顯示無血清培養(yǎng)基在原代有更高的集落形成率，體外傳代時間也更長；hSF和mEF都能支持人類EG細胞的體外增殖，差異不顯著。 比較胎齡對人類EG細胞原代集落分離效率的作用，說明7～9周是人類EG細胞最佳的分離時機。 3.無異源體系對人類EG細胞體外增殖的作用 對比人類EG細胞在KSR