靶向作用牛Oct-4基因的microRNA分子及其功能驗(yàn)證.pdf

1、microRNA(miRNA)是一類長約22個(gè)堿基的非編碼RNA分子，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，并在細(xì)胞的繁殖、分化、凋亡等過程中起著重要的調(diào)控作用?，F(xiàn)在已經(jīng)公布了108條牛的miRNA。尋找牛更多的miRNA分子并確定其靶基因，或者尋找作用于重要基因的miRNA分子，為研究牛的胚胎發(fā)育及轉(zhuǎn)基因牛的制備提供有價(jià)值的科學(xué)數(shù)據(jù)，已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。 本研究將人、小鼠、豬、狗、綿羊五種哺乳動(dòng)物的miRNA分子與牛的基因組對(duì)比，預(yù)測(cè)得到

2、了147條可能新miRNA分子。但是預(yù)測(cè)獲得的miRNA分子必須通過實(shí)驗(yàn)方法證明其表達(dá)。而利用小分子RNA克隆的方法則可以直接對(duì)miRNA分子進(jìn)行大量擴(kuò)增，測(cè)序后便可尋找出新的miRNA分子。本實(shí)驗(yàn)從牛的腦和肝臟組織中克隆得到了13條新的miRNA分子，其中有8條miRNA 分子與運(yùn)用同源對(duì)比預(yù)測(cè)得到miRNA分子相同，充分說明了這兩種方法均可行和有效。根據(jù)miRNA的作用機(jī)理，將牛的原有的與可能的新miRNA分子與牛Oct-4mRNA

3、 3’UTR比對(duì)，找到了5條調(diào)控Oct-4基因的候選miRNA 分子。首先使用人工合成化學(xué)修飾的miRNA 分子轉(zhuǎn)染表達(dá)RFP-3’UTR的轉(zhuǎn)基因COS7細(xì)胞，觀察熒光變化初步確定miRNA-146b和204具有調(diào)控作用；然后構(gòu)建miRNA表達(dá)載體再次轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)基因COS7細(xì)胞，通過FACS檢測(cè)，證明這兩條miRNA分子確實(shí)對(duì)具Oct-4具有調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)從尋找牛新的及作用于Oct-4的miRNA分子開始，通過兩個(gè)層次的實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了miR