CD40-CD40L信號通路調(diào)控調(diào)節(jié)性B細(xì)胞在HSP和HSPN中的作用機(jī)制研究.pdf

1、本文對CD40/CD40L信號通路調(diào)控調(diào)節(jié)性B細(xì)胞在HSP和HSPN中的作用機(jī)制進(jìn)行了研究。本研究分為兩個部分：
　　第一部分：調(diào)節(jié)性B細(xì)胞對HSP和HSPN患兒Th17/Treg免疫平衡的影響。過敏性紫癜（HSP）是兒童時期最常見的自身免疫性血管炎，并發(fā)腎臟損害時稱為紫癜性腎炎（HSPN）。大量研究顯示CD4+T細(xì)胞亞群（Th1，Th2，Th17和Treg）功能紊亂參與兒童HSP的發(fā)生發(fā)展，包括 Th1/Th2的免疫失衡和 Th

2、17/Treg的免疫失衡。同時，有研究指出Th17/Treg的免疫失衡與HSPN腎臟損害的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。而目前尚無研究中心就不同腎臟累及程度的 HSPN患兒進(jìn)行分組詳細(xì)討論Th17、Treg細(xì)胞比例及 Th17/Treg比值在其中的具體變化。調(diào)節(jié)性 B細(xì)胞作為一群能通過分泌IL-10調(diào)控CD4+T細(xì)胞免疫反應(yīng)的負(fù)向調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞，參與影響Th17/Treg的免疫平衡，在多種自身免疫性疾病中得到了普遍研究，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE），

3、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA），炎癥性腸病（IBD）等，但是其在兒童 HSP及 HSPN中是否能影響Th17/Treg的免疫平衡，進(jìn)而在 HSP的發(fā)生和HSPN腎臟損害及預(yù)后中發(fā)揮作用，目前尚不清楚。因此本研究通過檢測HSP及HSPN患兒外周血Th17、Treg細(xì)胞的比例和Th17/Treg比值的變化，調(diào)節(jié)性B細(xì)胞及其兩個亞群(CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞和CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞)在其中的比例變化及其與Th17、Tre

4、g和Th17/Treg的相關(guān)性分析，初步探索調(diào)節(jié)性B細(xì)胞對Th17/Treg免疫平衡的影響。
　　目的：探討調(diào)節(jié)性B細(xì)胞水平、功能異常可能通過影響Th17/Treg免疫平衡在HSP和HSPN的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮作用。
　　方法：選取確診的HSP及HSPN患兒76例，根據(jù)腎臟累及情況分為以下幾組：無腎臟累及組20例（Group A），單純鏡下血尿組12例（Group B），單純少量蛋白尿組17例（Group C），血尿合并少

5、量蛋白尿組15例（Group D），大量蛋白尿組12例（Group E）；HSP/HSPN緩解期患兒（皮疹、腹痛、關(guān)節(jié)痛、血尿、蛋白尿等癥狀消失）16例（Group F），健康對照者16例（Control）。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血中CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞、CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞，Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的百分比，以及CD19+B細(xì)胞、CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞和CD19+CD24hiC

6、D27+B細(xì)胞IL-10的表達(dá)水平；同時對B10細(xì)胞及其兩個亞群與Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞和Th17/Treg的比值進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　結(jié)果：與Control組相比，Group A, B, C, D, E組中Th17細(xì)胞的比例明顯升高（P<0.05）；Treg細(xì)胞的比例明顯降低（P<0.05）；Th17/Treg的比值明顯升高（P<0.05）；Group B, C, D, E中CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞的比例和B

7、10細(xì)胞、CD19+CD24hiCD38hiB、CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞分泌 IL-10的水平顯著降低（ P<0.05）；Group D， E中CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞的比例顯著降低（P<0.05）。與Group A相比， Group D, E中Th17細(xì)胞的比例、Th17/Treg的比值明顯升高（P<0.05）；B10、CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞的比例及分泌 IL-10的水平明顯降低（P<0.

8、05）；GroupE中Treg細(xì)胞、CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞及其IL-10的分泌水平顯著降低（P<0.05）。Group F組中上述指標(biāo)與 Control和Group A相比均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。B10、CD19+CD24hiCD38hiB和CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞與Th17細(xì)胞以及Th17/Treg的比值呈顯著負(fù)相關(guān)（ P<0.05）， B10和 CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞與CD

9、4+CD25+Treg細(xì)胞呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。
　　結(jié)論：B10細(xì)胞及其兩個亞群水平及功能異常（分泌IL-10的能力降低）可能參與HSP/HSPN的Th17/Treg免疫失衡。
　　第二部分：CD40/CD40L信號通路-調(diào)節(jié)性B細(xì)胞-Th17/Treg軸參與HSP和HSPN發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸。除了細(xì)胞免疫功能紊亂，大量研究表明HSP患兒體內(nèi)也存在體液免疫功能紊亂，表現(xiàn)為血漿中IgA水平明顯增高和血管壁IgA循環(huán)免疫復(fù)

10、合物的沉積。而 CD40-CD40L，作為特異性免疫系統(tǒng)中重要的一對共刺激分子，其在誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖、免疫球蛋白類型轉(zhuǎn)換及抗體的合成和分泌中發(fā)揮重要作用，在機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)中均起重要作用。既往研究發(fā)現(xiàn)CD40L在HSP患兒外周血中表達(dá)異常增高，導(dǎo)致免疫球蛋白產(chǎn)生異常，進(jìn)而在HSP的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。CD40/CD40L信號通路在B細(xì)胞調(diào)控T細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用。CD40/CD40L相互作用促進(jìn) B細(xì)胞分

11、泌 IL-10、TGF-β等抑制性細(xì)胞因子，從而抑制致病性的 T細(xì)胞的活化和分化，提示 CD40的表達(dá)與 B細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能密切相關(guān)。最近 Tedder等研究發(fā)現(xiàn)，B細(xì)胞在體外經(jīng)CpG和CD40L共刺激48h后，能最大程度的誘導(dǎo)B10前體細(xì)胞向B10細(xì)胞分化，提示CD40/CD40L信號通路可能參與B10細(xì)胞的分化。然而，Liu等在人體B細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)TLR通過介導(dǎo)STAT3和ERK的活化調(diào)控IL-10的分泌，BCR和CD40/CD4

12、0L與這一過程無關(guān)。所以，CD40/CD40L信號通路在B10細(xì)胞分化中的作用尚存在爭議。因此本研究通過檢測經(jīng) CD40L和 anti-CD40L mAb處理后PBMC中B10細(xì)胞及其兩個亞群(CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞和CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞)、Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞以及 B10細(xì)胞、CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞和CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞分泌IL-10的水平變化，旨在探討HS

13、P及HSPN患兒體內(nèi)CD40/CD40L信號通路在外周血B10細(xì)胞分化中的可能作用。
　　目的：探索CD40/CD40L信號通路異常是影響調(diào)節(jié)性B細(xì)胞水平及功能的關(guān)鍵。
　　方法：選取確診的HSP和HSPN患兒76例，根據(jù)腎臟累及情況分為以下幾組：無腎臟累及組20例（Group A），單純鏡下血尿組12例（Group B），單純少量蛋白尿組17例（Group C），血尿合并少量蛋白尿組15例（Group D），大量蛋白尿組1

14、2例（Group E）；HSP緩解期患兒（皮疹、腹痛、關(guān)節(jié)痛、血尿、蛋白尿等癥狀消失）16例（Group F），健康對照者16例（Control）。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血PBMC經(jīng)LPS刺激7h后CD19+CD40+B細(xì)胞的比例以及其分泌IL-10的水平，檢測經(jīng) CpG+CD40L刺激48h后 CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞、CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞、Th17細(xì)胞和 Treg細(xì)胞的百分比，以及B10pro+B1

15、0細(xì)胞，CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞、CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞分泌 IL-10的水平；檢測 CpG+anti-CD40L mAb刺激48h后B10pro+B10細(xì)胞，Th17，Treg細(xì)胞的比例以及CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞和CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞分泌IL-10的水平。
　　結(jié)果：與Control組相比，Group A, B, C, D, E組中CD19+CD40+B細(xì)胞的比

16、例增高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），Group B, C, D, E中CD19+CD40+B細(xì)胞分泌IL-10的水平明顯降低（P<0.05）；Group F中CD19+CD40+B細(xì)胞的比例及其 IL-10的分泌水平無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。CpG+CD40L刺激48h后 CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞、CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞、Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞的比例、Th17/Treg的比值以及 B10p

17、ro+B10細(xì)胞、CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞、CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞分泌IL-10的水平在Group A, B, C, D, E, F中均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（ P>0.05）。與 CpG+CD40L刺激48h相比， CpG+anti-CD40L mAb刺激48h后， B10pro+B10細(xì)胞、CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞、CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞分泌IL-10的水平和Treg的比例明顯降