抗腫瘤血管生成基因重組融合蛋白的研制.pdf

1、根據(jù)惡性實(shí)體腫瘤的血管依賴性原理，抗腫瘤血管生成治療已成為當(dāng)今腫瘤生物治療的研究熱點(diǎn)，并且顯示出良好的應(yīng)用前景。已分離出的多種有效內(nèi)源性血管生成抑制因子，包括PF4，血管抑素K1區(qū)域，人纖溶酶原K5區(qū)域，Endostatin，F(xiàn)LT(1-3)，KDR(1-3)等，以及利用血管生成因子(VEGF121，VEGF165)發(fā)展高度血管靶向性的“生物導(dǎo)彈”，已逐步用于臨床研究中。 本課題目的：利用基因重組技術(shù)，將上述眾多因子拼接為多種組

2、合的融合基因，構(gòu)建多功能、多靶點(diǎn)作用的基因工程藥物；利用畢赤酵母GS115系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵及融合蛋白的批量分離純化；體外體內(nèi)生物學(xué)活性測(cè)定，探討多靶點(diǎn)作用的基因工程藥物在抑制腫瘤血管生成方面的可行性。 本課題通過(guò)搭建兩個(gè)技術(shù)平臺(tái)，構(gòu)建了9個(gè)重組酵母工程菌。它們是以PFK為平臺(tái)的系列A，包括pPICZαA-PFK/GS115，pPICZαA-PFK-K5/GS115，pPICZαA-PFK-EN/GS115和pPICZαA-P

3、FK-FLT(1-3)/GS115；以K1為平臺(tái)的系列B，包括pPICZαA-K1-EN(A)/GS115，pPICZαA-K1-EN(B)/GS115，pPICZαA-K1-VEGF121/GS115，pPICZαA-K1-VEGF165/GS115和pPICZαA-K1-KDR(1-3)/GS115。其中，三個(gè)重組酵母工程菌，pPICZαA-PFK/GS115，pPICZαA-PFK-K5/GS115和pPICZαA-K1-EN(A

4、)/GS115，能穩(wěn)定高表達(dá)融合蛋白。 利用畢赤酵母GS115系統(tǒng)，甲醇誘導(dǎo)，在搖瓶和發(fā)酵罐兩個(gè)水平上摸索高密度發(fā)酵和誘導(dǎo)表達(dá)條件。三種重組融合蛋白PFK,PFK-K5和K1-EN的產(chǎn)量分別為，搖瓶：95.0mg/L，97.2mg/L和30.3mg/L；發(fā)酵罐：103.5mg/L，275mg/L和113.4mg/L。利用自制賴氨酸親和層析柱，批量分離純化融合蛋白，三種重組融合蛋白PFK,PFK-K5和K1-EN的純度分別為95％