Latcripin-13功能域的克隆表達、純化及其生物學活性研究.pdf

1、背景:肺癌是威脅人類生命健康最大的惡性腫瘤之一。其發(fā)病機制復雜，現(xiàn)代醫(yī)學手段缺乏對其早期檢測和篩選的有效方法。人們在分子水平上對肺癌的認識明顯不足，這就迫切需要通過尋找肺癌的新分子特征和靶點來改進診斷方法并最終達到靶向治療。
　　許多有效的抗癌藥物已從自然資源中開發(fā)。大多數(shù)抗癌藥物都來自動植物的次生代謝產(chǎn)物和其它小分子化合物。然而，近年來生物大分子的活性引起了研究人員的廣泛關注。蚯蚓纖溶酶(EFE)在體外和體內(nèi)都對肝癌細胞表現(xiàn)出顯

2、著的抗腫瘤活性。此外，來自云芝CM-101菌株的一種糖蛋白在體內(nèi)體外都表現(xiàn)出了顯著的抗腫瘤活性。此外，天花粉蛋白——Ⅰ型核糖體失活蛋白，可抑制多種腫瘤細胞株的生長并誘導凋亡。香菇是世界第二大食用菌，同時也是我國特產(chǎn)之一。香菇隸屬于擔子菌綱，傘菌目，口蘑科，香菇屬。香菇含有高蛋白、低脂肪、多糖、多種氨基酸和多種維生素，是一種名貴的食藥兩用真菌，在民間素有山珍之王之稱。香菇中含有的香菇多糖可以提高機體的免疫力。香菇中的水提取物對體內(nèi)的過氧化

3、氫有一定的消除作用，在一定程度上也起到延緩衰老的作用。除此之外，香菇對糖尿病，肺結核，傳染性肝炎，神經(jīng)炎，便秘，降血壓，降膽固醇，降血脂等起治療作用，又可預防動脈硬化，肝硬化等疾病。
　　我課題組自1990年開始，根據(jù)當時國際針對香菇藥用價值研究，采用生物工程發(fā)酵技術對6株香菇進行菌絲發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)一株經(jīng)發(fā)酵后其發(fā)酵液具有直接抗腫瘤作用，因該菌株于1991年3月開始研究，故命名為“C91-3”，“C”表示“China”。
　　基

4、于發(fā)酵液中的一些蛋白組分在體內(nèi)外的實驗中表明具有誘導細胞凋亡的能力，我課題組對香菇C91-3菌株轉(zhuǎn)錄組進行了高通量測序，獲得了大量的Unigene及其功能注釋信息。其中Unigene為28923條，具有編碼框的Unigene有18120條。根據(jù)基因功能注釋初步結果，利用在線工具軟件Sanger Pfam進行結構域分析，從Unigene序列中篩選出凋亡相關基因Latcripin-13。根據(jù)Latcripin-13轉(zhuǎn)錄組序列設計引物，用3'

5、-Full RACE(Rapid Amplificatioon of cDNA Ends, RACE)、5'-Full RACE方法獲得Latcripin-13基因編碼序列(Coding Sequence，CDS)。目前，我們已經(jīng)完成了Latcripin-13基因編碼序列在GenBank上的序列注冊(Accession Number:KF682439)。
　　目的:通過構建pET-32a(+)表達載體將香菇C91-3菌株凋亡相關蛋

6、白Latcripin-13功能域在大腸桿菌Rosetta-gami(DE3)中進行誘導表達，同時對表達產(chǎn)物進行鑒定。通過誘導表達香菇C91-3菌株凋亡相關蛋白Latcripin-13功能域，研究其對腫瘤細胞的生物學功能影響，探討其誘導腫瘤細胞凋亡的機制，為將其開發(fā)成為新型抗腫瘤藥物提供依據(jù)。
　　方法:①提取香菇C91-3菌株菌絲體總RNA，參照轉(zhuǎn)錄組的測序結果，通過3'-FullRACE、5'-Full RACE方法獲得Latc

7、ripin-13基因編碼序列。經(jīng)生物信息學軟件分析該蛋白的氨基酸組成和理化性質(zhì)及結構域。②設計特異性引物，利用RCR技術獲得Latcripin-13功能域序列并將其基因克隆到原核表達載體pET32a(+)中，構建原核重組表達質(zhì)粒pET32a(+)-truncated-latcripin-13，將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Ecoli.Rosetta-gami(DE3)中并進行誘導表達，用SDS-PAGE及Western blot方法對表達產(chǎn)物進

8、行鑒定。用鎳柱親和層析的方法進行分離純化并用BCA法測定蛋白濃度。用尿素梯度透析的方法對目的蛋白進行復性，并用圓二色光譜的方法對復性后的蛋白進行鑒定。③Latcripin-13功能域抗腫瘤活性的鑒定:MTT(Methyl ThiazolyLtetraZolium，MTT)法測定其對人肺腺癌A549細胞的增殖抑制率;用FITC標記Latcripin-13功能域，并用熒光顯微鏡觀察其在A549細胞中的定位;用電鏡法檢測其對A549細胞形態(tài)學

9、的影響;用33258染色法檢測觀察其對A549細胞凋亡的影響;流式細胞術檢測其對A549細胞的凋亡作用及細胞周期的影響;JC-1的方法檢測其對A549細胞線粒體膜電勢的影響;用分光光度法檢測其對caspase-3，-8，-9酶活性的影響;用Western blot的方法檢測Bcl-2，Bax，CCD1，CDK4，NF-κB，GSK3β，p-GSK3β表達水平的變化。
　　結果:①利用RACE方法獲得了Latcripin-13基因編

10、碼序列。通過對Latcripin-13氨基酸序列進行結構域分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白三級結構含有染色體濃縮調(diào)節(jié)子(RCC1)和植物同源結構域(PHD)。②應用PCR技術獲得了latcripin-13功能域基因片段，通過BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切驗證插入pET32a(+)中的片段為latcripin-13功能域基因片段。SDS-PAGE和Western blot結果證明蛋白Latcripin-13功能域在大腸桿菌Ecoli.Rosetta-gami

11、(DE3)中成功誘導表達。利用親和層析的方法將其成功純化，圓二色光譜驗證結果顯示其復性成功。③MTT法檢測結果顯示，Latcripin-13功能域作用于A549細胞呈現(xiàn)出濃度和時間的依賴關系(P＜0.05);熒光顯微鏡觀察其確實進入A549細胞，并分布在細胞核周圍;電鏡的結果顯示該蛋白誘導A549細胞發(fā)生凋亡，并呈現(xiàn)出早期凋亡的基本現(xiàn)象;33258染色結果顯示，該蛋白確實能誘導A549細胞凋亡，并呈現(xiàn)出核碎裂和染色體皺縮等凋亡現(xiàn)象;流式

12、細胞術結果顯示，100μg/ml該蛋白誘導A549細胞凋亡呈現(xiàn)出時間依賴關系，同時100μg/mlBSA對照組對A549無顯著凋亡的作用;細胞周期檢測結果顯示，Latcripin-13功能域蛋白對A549細胞產(chǎn)生G0/G1期阻滯作用。JC-1結果顯示，隨著Latcripin-13功能域蛋白作用濃度的增加，線粒體膜電勢發(fā)生改變;分光光度法結果顯示，100μg/ml該蛋白作用于A549細胞時，caspase-3，-8，-9被活化;Weste

13、rn blot結果顯示，隨著Latcripin-13功能域蛋白作用濃度的增加，Bax/Bcl-2比值增加(p＜0.05)，GSK3β/p-GSK3β比值增加(p＜0.05)，NF-κB，CCD1，CDK4表達量降低。
　　結論:①根據(jù)香菇C91-3菌株的轉(zhuǎn)錄組序列，成功篩選出凋亡相關基因Latcripin-13，并成功獲得Latcripin-13基因編碼序列。②成功獲得Latcripin-13功能域片段序列;重組質(zhì)粒pET32a(

14、+)-truncated-latcripin-13成功構建;目的蛋白Latcripin-13功能域在大腸桿菌Ecoli.Rosetta-gami(DE3)中成功表達;蛋白Latcripin-13功能域通過親和層析成功純化;包涵體蛋白Latcripin-13功能域經(jīng)尿素梯度透析成功復性。③Latcripin-13功能域蛋白進入人肺腺癌A549細胞系并對其具有誘導凋亡作用，其可能通過細胞周期G1期阻滯，NF-κB途徑和線粒體途徑共同作用其凋