IL-6和TNF-α經(jīng)NF-κB-miR-34a-miR-31-Foxp3信號(hào)軸導(dǎo)致Treg-Th17細(xì)胞失衡.pdf

1、目的：
　　在本實(shí)驗(yàn)室前期生物信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，本研究通過在體外誘導(dǎo)分泌白細(xì)胞介素17的輔助性T（Interlukin-17 producing helper T，Th17）細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T（regulatory T，Treg）細(xì)胞，探討腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor-alpha， TNF-α）及白細(xì)胞介素6（Interlukin-6，IL-6）等通過調(diào)控miR-34a和miR-31的表達(dá)，繼而mi

2、RNAs引起Treg細(xì)胞中叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3（Forkhead/winged helix transcription factor3，F(xiàn)oxp3）的表達(dá)水平的變化，使得表達(dá)Foxp3的Treg細(xì)胞與表達(dá)維甲酸相關(guān)核孤兒受體γt（RAR-related orphan receptor gamma，RORγt）的Th17細(xì)胞間的比例失衡，進(jìn)一步導(dǎo)致以異常炎癥反應(yīng)為特征的自身免疫性疾病的發(fā)生。部分闡明在炎癥因子的作用下miRNAs導(dǎo)致T

3、reg/Th17細(xì)胞失衡的機(jī)制有助于更深入地揭示一些自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制，為自身免疫性疾病的治療提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　在以往生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)上，首先驗(yàn)證miR-34a、miR-31與Foxp3表達(dá)的相互關(guān)系。利用 DNA重組技術(shù)構(gòu)建表達(dá)小鼠miR-31的慢病毒質(zhì)粒和逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒（pLV-miR-31及MGP-31），將pLV-miR-31，MGP-31及本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的pSMPUW-miR-34a與表達(dá)

4、小鼠 Foxp3基因的pCDNA-mFoxp3-3’-UTR（PFU）真核重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至人胚腎293T（HEK-293T）細(xì)胞，通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)（Quantitative real-time PCR，qPCR）檢測(cè)Foxp3轉(zhuǎn)錄水平的變化，免疫印跡技術(shù)（Immunoblot）檢測(cè)Foxp3翻譯水平的變化。此外，采用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（Transforming growth factor-beta，TGF-β）分別與小鼠外周CD4+T

5、細(xì)胞和小鼠T淋巴瘤細(xì)胞系EL4細(xì)胞共培養(yǎng)體外誘導(dǎo)Treg細(xì)胞和Foxp3+EL4細(xì)胞，分別檢測(cè)miR-34a及miR-31與Foxp3表達(dá)水平的相關(guān)性。接下來，為進(jìn)一步驗(yàn)證炎癥因子是否參與調(diào)控 miR-34a和miR-31，采用免疫磁珠純化CD4+CD62L+的初始 T細(xì)胞（Na?ve T cells）經(jīng)抗小鼠-CD3及抗小鼠-CD28單克隆抗體（anti-mouse CD3/CD28 mAb）活化，加入炎癥細(xì)胞因子組合體外誘導(dǎo)Th17

6、細(xì)胞，胞內(nèi)染色鑒定CD4+IL-17+Th17細(xì)胞的百分比以評(píng)估 Th17細(xì)胞的純度，并采用qPCR測(cè)定miR-34a及 miR-31的表達(dá)水平。同時(shí)，利用 IL-6及 TNF-α這兩類Th17細(xì)胞相關(guān)的炎癥細(xì)胞因子分別刺激小鼠CD4+T和EL4細(xì)胞，利用qPCR檢測(cè)炎癥因子作用下miR-34a及miR-31的表達(dá)水平，并通過Immunoblot檢測(cè)NF-κB磷酸化的水平及Foxp3的蛋白表達(dá)水平。最后，在IL-6和TNF-α等炎癥因子

7、模擬的微環(huán)境中以及核轉(zhuǎn)錄因子κB（Nuclear transcription factor-kappa B，NF-κB）信號(hào)活化和抑制的調(diào)節(jié)下，利用qPCR檢測(cè)miR-34a及miR-31的表達(dá)水平，并通過流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）及Immunoblot技術(shù)檢測(cè)Foxp3的蛋白水平以分析其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　結(jié)果：
　　DNA測(cè)序結(jié)果表明，所構(gòu)建慢病毒重組質(zhì)粒pLV-miR-31及逆轉(zhuǎn)錄病毒重組質(zhì)粒M

8、GP-31中miR-31的前體序列正確；qPCR及Immunoblot結(jié)果表明miR-34a不抑制Foxp3的mRNA水平，但可抑制Foxp3的蛋白表達(dá)水平，而miR-31既可抑制 Foxp3的mRNA水平也可抑制 Foxp3的蛋白水平。在 TGF-β誘導(dǎo)的iTreg與Foxp3+EL4細(xì)胞中，miR-34a及miR-31表達(dá)水平下調(diào)同時(shí)Foxp3表達(dá)上調(diào)，表明miR-34a及miR-31與Foxp3的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。采用白細(xì)胞介素1

9、β（Interlukin-1 beta，IL-1β）、IL-6、白細(xì)胞介素-23（Interlukin-23，IL-23）、TGF-β、γ-干擾素中和抗體（Interferon-gamma neutralizing antibody，anti-IFN-γ）和白細(xì)胞介素-4中和抗體（Interlukin-4 neutralizing antibody，anti-IL-4）等炎癥因子在體外與初始T細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)高純度的Th17細(xì)胞中，miR

10、-34a及miR-31在Th17細(xì)胞中表達(dá)水平顯著升高，提示某些炎癥細(xì)胞因子參與調(diào)節(jié)miR-34a及miR-31的轉(zhuǎn)錄活性。單獨(dú)采用IL-6或TNF-α與小鼠CD4+T細(xì)胞或EL4細(xì)胞共育時(shí)， IL-6和TNF-α均可上調(diào)miR-34a及miR-31的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)NF-κB磷酸化水平并抑制 Foxp3的翻譯。EL4細(xì)胞加入 NF-κB抑制劑（BAY11-7082）可下調(diào)miR-34a及miR-31，并逆轉(zhuǎn)了NF-κB對(duì)Foxp3的翻譯