基于生物大分子材料的肝臟組織工程學(xué)研究.pdf

1、肝移植是目前發(fā)生肝功能衰竭病人的最好治療途徑，但是由于受到器官短缺的限制，且醫(yī)療費用高昂，需要終身抑制免疫功能，因此肝移植難以受惠于更多肝病患者?；诟杉毎蜕锊牧显谄鞴僭偕矫娴难杆侔l(fā)展，尋找合適的生物材料編織成一種可支撐干細胞的支架是目前肝臟組織工程學(xué)需解決的科學(xué)問題。HCCs的合成基于膠原蛋白和殼聚糖的交聯(lián)作用，聯(lián)合HGF后進一步分析材料學(xué)綜合特性。AFP，ALB和HNF4a基因表達量用于分析BMSCs的分化情況;Periodi

2、c-schiff染色用于評估糖原合成;CK18和ALB的免疫熒光檢測評估干細胞分化程度。本實驗進一步開展了搭載HGF的HCCs聯(lián)合BMSCs動物體內(nèi)移植實驗。觀察了移植組織CK18免疫組化和CK19免疫熒光。檢測術(shù)后兩周移植組織ALB，CYP2C9及UGT2的含量。
　　第二部分實驗中利用3D生物打印機編織了一種3D肝實質(zhì)細胞-水凝膠支架進行肝臟組織工程學(xué)研究。3D水凝膠在體外實驗中被檢測到具有良好的生物相容性。在SD大鼠體內(nèi)開展

3、移植實驗，對照組，水凝膠組，水凝膠+HL-7702細胞和水凝膠+HGF分別被植入行可致死量的3/4大部分肝臟切除后的大鼠肝臟內(nèi)。術(shù)后1天、5天、10天檢測不同組別大鼠血清ALT，ALB，AST及總膽紅素含量，進行移植組織中CYP1A2，CYP2C9，a-GST和UGT-2含量進行比較。2周后觀察移植組織形態(tài)。移植組織取材后行H.E.染色，免疫組化CK18和Ckit進行觀察比較。比較各組大鼠生存曲線變化情況。
　　第三部分實驗中利用

4、3D生物打印機編織了一種3D分化的骨髓間充質(zhì)干細胞-水凝膠支架進行肝臟組織工程學(xué)研究。利用3D生物打印技術(shù)在三維環(huán)境下規(guī)則種植和培養(yǎng)分化骨髓間充質(zhì)干細胞，在水凝膠的幫助下在體外形成類似肝臟三維結(jié)構(gòu)形態(tài)，可持續(xù)發(fā)揮肝臟所特有的功能。qPCR用于檢測干細胞分化后ALB，HNF4a和AFP的表達;Periodic-Schiff染色用于評價干細胞分化后糖原的合成;CK18免疫熒光染色觀察細胞分化程度。MTT評價水凝膠3D生物打印后的生物相容性。

5、在3天、7天和10天檢測打印組織的體外合成GST，ALB和CYP2C9水平。最后將3D打印組織進行SD大鼠皮下移植進行體內(nèi)實驗。分別在2周和4周定量檢測移植組織中ALB，CYP2C9和GST的含量。分別在2周和4周檢測不同組別中的ALB、AFP和HNF4a的mRNA表達量。各組移植組織在2周和4周分別取材后行免疫組化CK18和Ckit進行觀察比較。傅立葉紅外光譜，熱重分析，降解速率測定，力學(xué)分析和溶脹分析結(jié)果表明本實驗所用的合成材料性能

6、良好。干細胞分化后AFP，ALB和HNF4a的mRNA表達量顯著增高，糖原合成顯著增多，CK18表達顯著增強。移植組織切片在偏振光顯微鏡下觀察到有新生組織，CK19免疫組化、CK18免疫熒光表達陽性。ALB，CYP2C9和UGT2的含量在搭載干細胞組中表達顯著增多。3D生物打印細胞-水凝膠支架并不影響細胞的活力。植入3D打印肝臟組織后，血清ALT，ALB，AST及總膽紅素，移植組織中CYP1A2，CYP2C9，a-GST和UGT-2的水

7、平發(fā)生顯著改善(p＜0.05)。移植組織的H.E.染色，免疫組化CK18和Ckit進行觀察發(fā)現(xiàn)3D打印組可形成形態(tài)規(guī)則，結(jié)構(gòu)清晰可見的肝臟微單元。各組大鼠的生存曲線比較發(fā)現(xiàn)3D打印組的中位生存期要好于其余各組且有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05）。骨髓間充質(zhì)干細胞分化培養(yǎng)后ALB、HNF4a和AFP的mRNA表達量變化顯著改變，具有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05）。分化后CK18表達陽性，PSA染色陽性。三維打印與二維培養(yǎng)、混合培養(yǎng)的生物相容性比較無

8、統(tǒng)計學(xué)差異。3D打印后ALB、GST和CYP2C9的含量在植入3天，7天和10天明顯改善(p＜0.05)。經(jīng)3D打印后再生的肝臟微單元形態(tài)規(guī)則，結(jié)構(gòu)清晰可見。移植組織中ALB、AFP和HNF4A的mRNA表達量明顯改善。體內(nèi)實驗結(jié)果3D打印組的ALB、GST和CYP2C9的含量在2周及4周與對照組相比明顯改善(P＜0.05)。搭載肝細胞生長因子的膠原殼聚糖支架聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)移植后形態(tài)規(guī)則，結(jié)構(gòu)完整，可持續(xù)穩(wěn)定發(fā)揮肝臟特殊功能