疫霉菌效應(yīng)因子的植物靶標(biāo)鑒定與功能研究.pdf

1、疫霉菌(Phytophthora capsici)隸屬于卵菌，可以引起多種作物的疫病，對(duì)經(jīng)濟(jì)造成巨大的損失，包括大豆疫霉、辣椒疫霉、致病疫霉、橡樹疫霉等。疫霉菌在進(jìn)化上與真菌相差甚遠(yuǎn)，和藻類同屬于茸鞭生物界，盡管和其他真菌一樣呈絲狀生長(zhǎng)，但是其致病機(jī)理與其他真菌差異顯著?；蚪M測(cè)序發(fā)現(xiàn)疫霉菌具有編碼大量效應(yīng)分子的基因，其中胞內(nèi)效應(yīng)因子包含RxLR和CRN(Crinkler)兩大類。RxLR效應(yīng)蛋白在結(jié)構(gòu)上可分為:信號(hào)肽、氨基端RxLR-

2、dEER轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域和羧基端功能結(jié)構(gòu)域三部分。研究表明RxLR-dEER類蛋白能夠進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)，且具有毒性功能。CRN效應(yīng)分子表達(dá)量較高，其高度分化的C末端結(jié)構(gòu)域表明了它們可能具有廣泛多樣的功能;而N末端包含有一個(gè)LxLFLAK保守基序，與RxLR具有類似的功能，能夠介導(dǎo)CRN效應(yīng)分子轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入植物細(xì)胞。盡管目前已經(jīng)有研究表明效應(yīng)因子在含有對(duì)應(yīng)抗病蛋白的植物上能夠引起植物抗性產(chǎn)生，但是對(duì)這些效應(yīng)蛋白和在感病植株上的作用及其機(jī)制還不清楚。<

3、br>　　酵母文庫(kù)的篩選:采用酵母雙雜交技術(shù)，以辣椒疫霉的效應(yīng)因子RxLR22、CRN4、RxLR242、RxLR207和大豆疫霉的效應(yīng)因子Avr1b為誘餌蛋白，在擬南芥的cDNA文庫(kù)中進(jìn)行寄主靶標(biāo)的篩選，并對(duì)所有的陽(yáng)性克隆進(jìn)行提質(zhì)粒和測(cè)序，在NCBI中比對(duì)出靶標(biāo)基因的全長(zhǎng)序列與功能信息，分別篩選92個(gè)、136個(gè)、69個(gè)、99個(gè)、90個(gè)克隆，比對(duì)后分別得到78、73、108、62、12個(gè)基因，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
　　辣椒疫霉

4、效應(yīng)因子與擬南芥抗病相關(guān)蛋白互作篩選與驗(yàn)證:本研究克隆了72個(gè)辣椒疫霉在侵染階段中表達(dá)量較高的效應(yīng)分子，其中包括CRN家族的34個(gè)，RxLR家族的38個(gè)，構(gòu)建到pGBKT7酵母表達(dá)載體上，利用酵母雙雜交技術(shù)，對(duì)11個(gè)擬南芥抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要基因（CMPG1、EDS1、BAK1、BIK1、OSD1、RIN4、PAD4、SGT1a、SGT1b、NPR1和NPR3）進(jìn)行了定向篩選。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:RxLR103能與EDS1、BAK1、BI

5、K1、NPR3互作，RxLR172能與EDS1、SGT1b互作，RxLR48能與NPR1互作，而RxLR237能自激活，并對(duì)所獲結(jié)果進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　轉(zhuǎn)基因擬南芥的制備:為了研究辣椒疫霉效應(yīng)因子RxLR103、RxLR172、RxLR237在遺傳學(xué)及生理生化上的功能，本文將目的基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體pART27中，轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，通過花序浸泡法進(jìn)行擬南芥穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，利用卡納抗性篩選出轉(zhuǎn)基因苗，后期發(fā)現(xiàn)Rx

6、LR103轉(zhuǎn)基因擬南芥植物表現(xiàn)為矮小現(xiàn)象，而且有一部分枯萎死亡，而RxLR172和RxLR237的轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)正常。這為以后的實(shí)驗(yàn)提供了材料基礎(chǔ)。
　　RxLR103初步的功能研究:RxLR103是辣椒疫霉的一個(gè)效應(yīng)分子，利用PVX載體和煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)RxLR103能夠引起煙草葉片上的細(xì)胞死亡，同時(shí)亞細(xì)胞定位顯示，RxLR103在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核上都有定位。RT-PCR分析表明該基因在辣椒疫霉的侵染后期上調(diào)表達(dá)，而毒性分析