鹽生杜氏藻EPSP合成酶基因的克隆、功能鑒定及其結(jié)構(gòu)的光譜學(xué)性質(zhì)分析.pdf

1、草甘膦是目前使用最為廣泛的一種廣譜性除草劑，具有對(duì)人畜低毒，低殘留，不破壞生態(tài)環(huán)境，雜草難對(duì)之產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)，有很高的商業(yè)價(jià)值。草甘膦作用的靶標(biāo)酶是EPSP合成酶(5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶，5-enolpyr- uvyl-shikimate-3-phosphate synthase)。該酶是催化莽草酸循環(huán)途徑第六步反應(yīng)的酶，是細(xì)菌、真菌以及植物體內(nèi)芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)生物合成過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶。草甘膦就是

2、通過(guò)抑制EPSP合成酶活性從而阻斷芳香族氨基酸的合成，來(lái)滅殺大多數(shù)的植物，雜草和農(nóng)作物皆不例外。因此，利用基因工程技術(shù)，通過(guò)改造EPSP合成酶或提高EPSP合成酶的表達(dá)量以提高作物對(duì)草甘膦的抗性，以擴(kuò)大草甘膦的應(yīng)用范圍，是當(dāng)今雜草科學(xué)和作物育種領(lǐng)域研究的重要內(nèi)容。 除此而外，由于莽草酸循環(huán)僅僅存在于植物、細(xì)菌和真菌中，而在哺乳動(dòng)物、魚類、鳥類、爬行動(dòng)物以及昆蟲當(dāng)中還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該途徑的存在，所以EPSP合成酶也被認(rèn)為是一個(gè)潛在的新型

3、抗生素作用的靶位點(diǎn)。因此，針對(duì)草甘膦與該酶相互作用的機(jī)制，以及尋找與草甘膦有相同作用的其他化合物，科學(xué)家們作出了大量的研究，為進(jìn)一步研究此類抗生素的設(shè)計(jì)打下了基礎(chǔ)。有報(bào)道指出缺乏了EPSP合成酶基因的病原菌不能正常存活，當(dāng)然也不能導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生。另外，有研究也證明了與莽草酸途徑中其他酶的相互作用也能夠產(chǎn)生抑菌的效果。 總之，EPSP合成酶在抗草甘膦農(nóng)作物以及新型抗生素的設(shè)計(jì)等方面都有著非常重要的應(yīng)用價(jià)值。因此，對(duì)于酶性質(zhì)、催化機(jī)

4、制以及結(jié)構(gòu)和功能相互關(guān)系的研究對(duì)于EPSP合成酶的改造以及新型抗生素的設(shè)計(jì)都有著非常重要的意義。就酶的催化機(jī)制而言，在某些方面還存在著截然相反的觀點(diǎn)，例如“僅僅是S3P與酶的結(jié)合能否改變酶的構(gòu)象”。有的研究者通過(guò)實(shí)驗(yàn)指出僅僅是S3P就能夠?qū)е旅笜?gòu)象的改變，而另一些研究者卻認(rèn)為只有2個(gè)底物都結(jié)合在酶上，才能改變酶的構(gòu)象。因而對(duì)新發(fā)現(xiàn)的EPSP合成酶的研究將為此類爭(zhēng)議性問(wèn)題提供全新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。迄今為止，已經(jīng)從原核和真核生物中純化出了EPSP

5、合成酶，并且在多個(gè)生物中也克隆得到了編碼EPSP合成酶的基因(aroA基因)。鑒于還未見藻類EPSP合成酶基因的相關(guān)報(bào)道，本文就鹽藻的EPSP合成酶基因開展了一系列的研究，并取得了以下結(jié)果： 1)克隆了鹽藻EPSP合成酶的全長(zhǎng)基因。 在實(shí)驗(yàn)室前期的工作中，已經(jīng)通過(guò)構(gòu)建鹽藻cDNA文庫(kù)得到了一段鹽藻EPSP合成酶基因的EST序列。在該序列的基礎(chǔ)上,通過(guò)3’RACE和5’RACE的方法將EST序列向著3’和5’的方向分別延長(zhǎng)

6、了約900 bp和1200 bp，經(jīng)拼接后得到了鹽藻EPSP合成酶基因的全長(zhǎng)cDNA序列，其中3’末端達(dá)到了PolyA尾巴。該cDNA序列已提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，GenBank的登陸號(hào)為EF051488。 2)通過(guò)生物信息學(xué)分析初步斷定克隆得到的cDNA序列屬于鹽藻EPSP合成酶基因。 經(jīng)分析，發(fā)現(xiàn)該cDNA編碼的最長(zhǎng)氨基酸序列與其他物種的EPSP合成酶有著非常高的相似性；同時(shí)我們也預(yù)測(cè)出了在鹽藻EPSP合成酶的N端有一

7、段葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，這與植物的EPSP合成酶是一致的；系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)鹽藻EPSP合成酶與細(xì)菌EPSP合成酶的親緣關(guān)系要比高等植物接近一些；功能結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白具有EPSP合成酶家族特有的模體；三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)也顯示出鹽藻EPSP合成酶與大腸桿菌EPSP合成酶在結(jié)構(gòu)上非常一致。這些結(jié)果都表明我們克隆得到的cDNA確實(shí)屬于鹽藻EPSP合成酶基因。 3)構(gòu)建了鹽藻EPSP合成酶基因的原核表達(dá)體系和并純化了重組蛋白。 利用

8、表達(dá)載體pGEX-4T-1構(gòu)建了含鹽藻aroA基因的重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)入到了大腸桿菌JM109中進(jìn)行表達(dá)；通過(guò)表達(dá)條件優(yōu)化我們發(fā)現(xiàn)使用 0.03mmol/L的IPTG在30℃的條件下對(duì)重組蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)能夠最大程度的得到可溶性的EPSP合成酶；在此基礎(chǔ)上，利用GST親和層析柱我們純化出了融合表達(dá)的鹽藻EPSP合成酶；最后通過(guò)凝血酶的作用，將GST標(biāo)簽蛋白除去，得到了正常大小的重組蛋白，為后續(xù)蛋白質(zhì)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)相關(guān)的研究打下了基礎(chǔ)。

9、4)在大腸桿菌體內(nèi)鑒定了鹽藻EPSP合成酶基因的功能。 將含鹽藻aroA基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到了aroA基因缺失的大腸桿菌ER2799中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入的鹽藻aroA基因能夠互補(bǔ)ER2799中缺失掉的aroA基因的功能，維持大腸桿菌ER2799體內(nèi)芳香族氨基酸的合成，使其能夠在M9最低限度培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；草甘膦抗性實(shí)驗(yàn)證明高表達(dá)的鹽藻EPSP合成酶能夠提高大腸桿菌對(duì)草甘膦的耐受性，并且可溶性蛋白的含量越高，大腸桿菌對(duì)草甘膦的耐受性越強(qiáng)

10、。這些都說(shuō)明了我們克隆得到的鹽藻EPSP合成酶基因在大腸桿菌體內(nèi)是以有活性的形式存在的。 5)探討了底物結(jié)合對(duì)于酶構(gòu)象變化的影響。 利用熒光光譜，我們分析了鹽藻EPSP合成酶在結(jié)合底物后構(gòu)象的變化情況，為該領(lǐng)域存在的爭(zhēng)議問(wèn)題提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。研究結(jié)果顯示僅僅是S3P的結(jié)合能導(dǎo)致酶熒光光譜微弱的改變，而酶在同時(shí)結(jié)合了S3P和PEP后，其熒光光譜變化加劇。因此我們認(rèn)為僅僅是S3P的結(jié)合能夠使得酶結(jié)構(gòu)發(fā)生小范圍的變化，但還不

11、能形成“close”的構(gòu)象；只有當(dāng)S3P和PEP都結(jié)合到了酶上后，酶才能發(fā)生劇烈的構(gòu)象變化，即從“open”構(gòu)象變成“close”構(gòu)象。除此而外，我們還發(fā)現(xiàn)，在添加了S3P和無(wú)機(jī)磷離子的EPSP合成酶中，酶的熒光光譜同樣發(fā)生了巨大的變化，這可能是因?yàn)闊o(wú)機(jī)磷離子能部分的占據(jù)PEP或者草甘膦在酶上的結(jié)合位點(diǎn)，從而與S3P一起改變酶的構(gòu)象。這解釋了部分研究者得到了“S3P-酶”二元復(fù)合物晶體為什么以“close”構(gòu)象存在。 6)培育了

12、草甘膦抗性鹽藻株并分析了其產(chǎn)生耐受性的原因。通過(guò)此部分實(shí)驗(yàn)我們希望獲得突變的有草甘膦耐受性的鹽藻EPSP合成酶，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)一些與草甘膦耐受性相關(guān)的氨基酸殘基。通過(guò)向鹽藻培養(yǎng)基中不斷的加入并提高草甘膦選擇壓，逐步培養(yǎng)出了能夠在不同草甘膦濃度下生長(zhǎng)的鹽藻，但是通過(guò)比較草甘膦耐受性鹽藻與正常鹽藻體內(nèi)的EPSP合成酶的氨基酸序列，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何位點(diǎn)的氨基酸突變。于是，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定了不同草甘膦濃度的抗性鹽藻體內(nèi)EPSP合成酶的表達(dá)差異

13、，結(jié)果顯示2.0mmol/L草甘膦抗性的鹽藻體內(nèi)EPSP合成酶mRNA的表達(dá)量是正常鹽藻的12倍。因此我們認(rèn)為所培養(yǎng)的鹽藻能對(duì)草甘膦產(chǎn)生耐受性的原因是其體內(nèi)EPSP合成酶的高效表達(dá)；進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了鹽藻需要一個(gè)及其緩慢的過(guò)程來(lái)高效表達(dá)自身的EPSP合成酶，以適應(yīng)高草甘膦濃度的外界環(huán)境。 綜上，我們首次從鹽藻中分離得到了EPSP合成酶的編碼基因；通過(guò)原核表達(dá)純化了重組蛋白，并鑒定了該基因的功能；研究了底物結(jié)合后鹽藻EPSP合成酶