導(dǎo)入β-半乳糖苷酶基因的重組腺病毒的純化.pdf

1、目的：伴隨工業(yè)、農(nóng)業(yè)和交通事業(yè)的發(fā)展，高能量創(chuàng)傷日益增多，周?chē)窠?jīng)損傷已成為臨床上比較常見(jiàn)的致殘性損傷，而針對(duì)周?chē)窠?jīng)損傷的治療一直是臨床上比較棘手的問(wèn)題，盡管顯微外科修復(fù)技術(shù)已經(jīng)十分精湛，但長(zhǎng)期以來(lái)難獲得滿意效果。隨著分子生物及基因工程的發(fā)展，當(dāng)今針對(duì)基因治療研究已成為周?chē)窠?jīng)損傷研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)課題。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)在中樞和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)中把攜帶目的基因的腺病毒作為載體(Adenovirus，AdV)導(dǎo)入后，目的基因就會(huì)適時(shí)地表達(dá)產(chǎn)物，從而

2、達(dá)到治療或者研究的目的。
　　其中在介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染方面腺病毒載體具有諸多優(yōu)點(diǎn)，因此在神經(jīng)示蹤研究、神經(jīng)再生和神經(jīng)運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病的診治中成為應(yīng)用最廣泛的載體。在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)導(dǎo)入以腺病毒作為載體的目的基因，通過(guò)目的基因在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的表達(dá)促進(jìn)周?chē)窠?jīng)的再生，同時(shí)也對(duì)神經(jīng)示蹤的研究的具有重要意義。
　　當(dāng)下，神經(jīng)修復(fù)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)是將各種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因融合到復(fù)制缺陷型重組腺病毒(Adenovirus，AdV)中，再將攜帶目的基因的腺病毒

3、轉(zhuǎn)入到脊髓或周?chē)窠?jīng)中來(lái)對(duì)受損的神經(jīng)元進(jìn)行保護(hù)或者在周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)中誘導(dǎo)周?chē)窠?jīng)的再生過(guò)程。腺病毒載體具有較高的感染效率、廣泛的宿主范圍、可以將分裂期或靜息期細(xì)胞感染、巨大的基因裝載量、容易提取高濃度病毒成分、毒性低水平表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)。利用分子生物技術(shù)克隆乳糖操縱子基因片段LacZ基因構(gòu)建腺病毒載體，制備病毒顆粒從而為進(jìn)一步研究腺病毒載體介導(dǎo)的LacZ基因在周?chē)窠?jīng)損傷中的應(yīng)用。
　　LacZ基因廣泛用于基因表達(dá)調(diào)控研究中的一種基因。L

4、acZ基因編碼的beta-半乳糖普酶(簡(jiǎn)稱beta-gal)是由4個(gè)亞基組成的四聚休，可催化乳糖的水解.Beta-gal比較穩(wěn)定，用X-Gal為底物進(jìn)行染色時(shí)，呈藍(lán)色，便于檢測(cè)和觀察.LacZ基因的諸多優(yōu)點(diǎn)使它成為基因工程實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)常用標(biāo)記基因，因此它被用于基因的時(shí)空表達(dá)、探測(cè)已知調(diào)控序列有效區(qū)段的位置和作用、尋找未知序列等領(lǐng)域。
　　因此，利用腺病毒安全、穩(wěn)定、高效以及LacZ基因特異性表達(dá)等特點(diǎn)當(dāng)下利用含LacZ基因的腺病毒

5、對(duì)周?chē)窠?jīng)損傷修復(fù)進(jìn)行研究已成為基因治療的前沿。但腺病毒可以被中和抗體迅速地清除，這是由于腺病毒載體的免疫原性比較強(qiáng)，在日常工作生活中腺病毒侵入人體后會(huì)誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗腺病毒中和抗體。如果接受腺病毒載體介導(dǎo)的基因治療后因?yàn)橹泻涂贵w會(huì)消滅腺病毒載體，從而導(dǎo)致腺病毒載體在體內(nèi)的數(shù)量減少而使基因治療失敗。為了達(dá)到持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、表達(dá)效果確切等效果，本實(shí)驗(yàn)將已有腺病毒通過(guò)轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞，通過(guò)在293細(xì)胞中的繁殖，從而提取出具有侵染力的濃縮的高純度病

6、毒。為下一步和今后研究將LacZ基因?qū)階dV后在中樞和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)內(nèi)的表達(dá)來(lái)促進(jìn)周?chē)窠?jīng)的再生奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.HEK293細(xì)胞的培養(yǎng)把凍存的細(xì)胞由-196℃的液氮中快速放入37℃水浴中融化，放入后緩慢搖晃凍存管，使細(xì)胞外冰晶融化。3000r/min離心3min融化好的細(xì)胞懸液。將上層的上清液吸去，并放入10ml培養(yǎng)液到離心管中，輕輕吹打成懸液，放入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。將盛有細(xì)胞和培養(yǎng)液培養(yǎng)瓶在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱

7、的環(huán)境接近人體環(huán)境，為37℃和5％CO2。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)均勻時(shí)，便可計(jì)數(shù)一定體積細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)。然后根據(jù)公式換算出細(xì)胞在每毫升細(xì)胞懸液中含有的量。細(xì)胞生長(zhǎng)到占瓶底面積的90％還需要2-3次傳代培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細(xì)胞，挑選形狀飽滿、生長(zhǎng)能力強(qiáng)的細(xì)胞接種病毒。
　　2.病毒轉(zhuǎn)染把293細(xì)胞放入75cm2培養(yǎng)瓶中后加入10mlDMEM5％進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至60％-70％時(shí)將培養(yǎng)液倒去，小心加入病毒混合液。十字形輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使培養(yǎng)液

8、蓋住細(xì)胞層。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90分鐘后加入9mlDMEM5％，再經(jīng)過(guò)72小時(shí)孵育，便可以通過(guò)MOI測(cè)定來(lái)判斷病毒顆粒。
　　3.腺病毒擴(kuò)增將細(xì)胞在-20℃到37℃分別放置半小時(shí)，反復(fù)三次。用離心管離心后收集上清液冰凍存于-20℃或-80℃。取三瓶培養(yǎng)理想的293細(xì)胞，倒掉里面的細(xì)胞培養(yǎng)液，將5ml混合液放到每個(gè)培養(yǎng)瓶中，輕輕晃動(dòng)混勻。放到培養(yǎng)箱中孵育，時(shí)間大約為90分鐘。向培養(yǎng)瓶中加入DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)，時(shí)間大約48-72小時(shí)。同

9、樣的方法從第一次被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中取上清后再次轉(zhuǎn)染細(xì)胞。便可得到再次擴(kuò)增的病毒。
　　4.病毒的純化離心細(xì)胞，待細(xì)胞碎片沉淀后取上清液。5 mlPEG8000放入每10ml上清液中，將上清放到冰上1小時(shí)使其沉淀。以12000 rpm的速度離心上述混合物，時(shí)間大約20 min。將上清液倒去后，在CsCl溶液中加入沉淀物。經(jīng)過(guò)5分鐘離心，收集病毒懸浮液。
　　5.50％組織培養(yǎng)感染劑量法測(cè)定病毒滴度取293細(xì)胞一瓶，用2％FCS/D

10、MEM將細(xì)胞濃度調(diào)整為為7.5×105/ml；將100μl細(xì)胞懸液分別放到2塊96孔板中。10孔為一個(gè)稀釋度，其中2孔作為陰性對(duì)照；經(jīng)過(guò)10天培養(yǎng)后鏡下觀察，數(shù)出每一排出現(xiàn)細(xì)胞病變現(xiàn)象(CPE)的孔的數(shù)目。并利用Karber方程計(jì)算滴度T=101+d(s-0.5)，測(cè)出AdLacZ病毒液的TCID50:1010TCID50/ml。
　　結(jié)果：
　　1.正常具有活力的HEK293細(xì)胞呈多角形，貼壁較疏松，細(xì)胞之間相互連成網(wǎng)狀，

11、并有聚集成團(tuán)的傾向。
　　2.含lacz基因的腺病毒轉(zhuǎn)染后的293細(xì)胞在培養(yǎng)24小時(shí)后即可在倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞變性即CPE現(xiàn)象而且通過(guò)X-g al染色后可觀察到細(xì)胞出現(xiàn)藍(lán)染，即檢測(cè)到報(bào)告基因lacz的表達(dá)，細(xì)胞表達(dá)出攜帶目的基因的腺病毒顆粒，對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)藍(lán)染表達(dá)。表明轉(zhuǎn)染成功。
　　3.在96孔板上培養(yǎng)293細(xì)胞，用獲得病毒感染293細(xì)胞后計(jì)數(shù)出現(xiàn)CPE孔個(gè)數(shù)，測(cè)定病毒滴度。最后獲得病毒滴度為1010TCID50/ml(