煙草抗馬鈴薯Y病毒miRNA的篩選及相關(guān)miRNA的功能分析.pdf

1、煙草是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，馬鈴薯Y病毒(PVY)是煙草上的主要病害之一，近幾年，PVY在我國煙草主要產(chǎn)區(qū)爆發(fā)成災(zāi)，并且存在逐年加重的趨勢。目前生產(chǎn)上對于PVY的防治尚無有效的藥劑，因此，培育抗PVY的煙草品種是防治該病害最為有效的辦法。然而，了解病毒與煙草相互作用的分子機(jī)理是解決這一問題的關(guān)鍵。
　　研究表明，microRNA(miRNA)在調(diào)節(jié)植物對病毒的抗性方面具有重要作用，本文在探究PVY侵染對植物內(nèi)源miRNA表達(dá)的變化的

2、基礎(chǔ)上，探索是否可以通過調(diào)控內(nèi)源miRNA基因的表達(dá)從而起到抗病毒作用，為煙草的病毒防治和抗病育種提供一個(gè)新的思路。本研究獲得的主要研究結(jié)果如下:
　　1.對PVY侵染煙草樣品及健康對照進(jìn)行了小RNA(smallRNA，sRNA)測序，通過分析PVY侵染后煙草內(nèi)源miRNA表達(dá)譜的變化，表明PVY能夠顯著影響煙草內(nèi)源81個(gè)miRNA表達(dá)發(fā)生變化，其中上調(diào)表達(dá)miRNA57個(gè)，下調(diào)表達(dá)21個(gè)，對表達(dá)差異的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測。<

3、br>　　2.選擇表達(dá)顯著上調(diào)的煙草nta-miR156g、nta-miR396b、nta-miR169a、nta-miR6149a，顯著下調(diào)的nta-miR6019a以及表達(dá)差異不顯著的nta-miR168a、nta-miR172c進(jìn)行Northern印跡雜交驗(yàn)證，雜交結(jié)果與測序及差異分析結(jié)果基本一致。
　　3.篩選出nta-miR396b作為本文的研究對象，構(gòu)建了nta-miR396b基因超量表達(dá)的植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)

4、的遺傳轉(zhuǎn)化，將nta-miR396b轉(zhuǎn)入煙草栽培品種“K326”中，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。將轉(zhuǎn)基因植株自交至T2代，用于后期研究。
　　4.對T2代轉(zhuǎn)基因煙草以未轉(zhuǎn)基因植株作為對照進(jìn)行PVY的抗病性鑒定，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草的發(fā)病延緩，癥狀較未轉(zhuǎn)基因煙草明顯減弱，證實(shí)煙草miR396b具有抗PVY侵染的功能。
　　本研究從miRNA的角度尋找PVY的防治途徑，證明了煙草內(nèi)源miRNA具有抗PVY侵染的功能。表明植物能以調(diào)節(jié)內(nèi)源m