通心絡(luò)抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　Ⅰ通心絡(luò)抑制動(dòng)脈粥樣硬化早期病變滋養(yǎng)血管增生的作用及其機(jī)制研究
　　背景：
　　研究表明，滋養(yǎng)血管(vasa vasorum，VV)增生與動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)斑塊的形成、進(jìn)展及易損性密切相關(guān)，而VV增生的程度和分布范圍受到促血管生長(zhǎng)因子與抑血管生長(zhǎng)因子間相互作用的調(diào)節(jié)。其中，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth

2、 factor，VEGF）家族及血管生成素(angiopoietin，ANGPT)家族起著重要的作用。研究表明，VEGF家族重要成員VEGF-A能夠通過(guò)促進(jìn)單核細(xì)胞活化、粘附、遷移及增加內(nèi)皮細(xì)胞的通透性而促進(jìn)內(nèi)膜增生、加重AS。人冠狀動(dòng)脈斑塊免疫組織化學(xué)染色顯示，VEGF-A在各個(gè)時(shí)期的斑塊均有陽(yáng)性染色，并且其陽(yáng)性染色率在動(dòng)脈粥樣化的病變處比彌散性?xún)?nèi)膜增厚病變處明顯增加。人頸動(dòng)脈斑塊免疫組化染色顯示，不穩(wěn)定斑塊中血管生成素家族成員ANG

3、PT-1的表達(dá)下降而ANGPT-2的表達(dá)升高。ANGPT-1與ANGPT-2的比值在出血的斑塊中減小，并且ANGPT-1/ANGPT-2與斑塊新生血管密度呈負(fù)相關(guān)。血管新生因子的表達(dá)受到缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor1α，HIF-1α)，E26轉(zhuǎn)化特異序列1（E26 transformation specific sequence1，Ets-1）等多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。HIF-1α的蛋白穩(wěn)定性及其轉(zhuǎn)錄活

4、性受到缺氧依賴(lài)性和非缺氧依賴(lài)性?xún)煞N信號(hào)通路的調(diào)控。AS斑塊內(nèi)膜增厚超過(guò)氧氣的彌散距離以及斑塊內(nèi)活躍的炎癥反應(yīng)狀態(tài)等因素均可引起HIF-1α的表達(dá)增加。多種炎癥因子和生長(zhǎng)因子可通過(guò)激活PI3 K/Akt/HIF-1α通路增加促血管生成因子VEGF-A、ANGPT-2、ANGPT-4等的表達(dá)。而Ets轉(zhuǎn)錄因子家族成員Ets-1可通過(guò)與ANGPT-2基因上的Ets結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合而激活A(yù)NGPT-2的啟動(dòng)子活性，增加ANGPT-2的表達(dá)。

5、　　復(fù)方中藥通心絡(luò)(Tongxinluo，TXL)于1996年被我國(guó)食品與藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于冠心病心絞痛和缺血性腦卒中的治療。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠心肌梗死和心力衰竭模型中，TXL干預(yù)能夠顯著增加小鼠缺血心肌區(qū)內(nèi)的新生血管密度、減輕心室重構(gòu)、改善心功能。那么斑塊VV增生對(duì)于早期斑塊的形成有無(wú)影響？斑塊VV增生促進(jìn)早期斑塊形成的機(jī)制是什么？TXL在抗心肌缺血的同時(shí)是否會(huì)對(duì)斑塊的血管新生產(chǎn)生相同的促進(jìn)作用進(jìn)而對(duì)斑塊的發(fā)生及穩(wěn)定性

6、產(chǎn)生影響？
　　基于以上分析，本研究擬采用高脂喂養(yǎng)載脂蛋白E敲基因(apolipoprotein Edeficient，apoE-/-)小鼠建立早期AS斑塊模型，觀察斑塊VV增生對(duì)于早期斑塊形成的影響，并進(jìn)一步探究TXL干預(yù)對(duì)AS斑塊血管新生以及早期斑塊形成的影響及可能的作用機(jī)制，也為該藥在臨床上的應(yīng)用提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的：
　　1.觀察TXL干預(yù)對(duì)apoE-/-小鼠斑塊VV增生及早期斑塊形成的影響;
　

7、　2.探討TXL干預(yù)影響血管新生的可能機(jī)制。
　　方法：
　　1.TXL超微粉及其溶液的制備
　　TXL復(fù)方中藥組分制備成直徑≤10μm的超微粉，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分，用生理鹽水溶解，制備TXL-生理鹽水混懸液，通過(guò)灌胃的方式給藥;體外實(shí)驗(yàn)部分，用細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶解制備成TXL儲(chǔ)存溶液。
　　2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立和分組
　　100只12周齡雄性apoE-/-小鼠，高脂飲食1周后，隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組（Contr

8、ol組，25只）和TXL干預(yù)組（75只）。為觀察TXL的劑量效應(yīng)，TXL干預(yù)組又分為T(mén)XL低劑量組（TXL-L，0.38g/kg/d，25只），TXL中劑量組(TXL-M，0.75g/kg/d，25只)和TXL高劑量組（TXL-H，1.5g/kg/d，25只）。Control組給予相同體積的生理鹽水。TXL干預(yù)5周后，所有小鼠行安樂(lè)死，留取各組小鼠血液及組織標(biāo)本。
　　結(jié)果：
　　1.apoE-/-小鼠的基本情況
　　

9、實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，所有小鼠均順利通過(guò)實(shí)驗(yàn)。各組間小鼠體重?zé)o顯著性差異。血液學(xué)檢測(cè)指標(biāo)包括血清TG、TC、LDL-C、HDL-C以及血糖水平，在各組小鼠間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.TXL對(duì)主動(dòng)脈環(huán)出芽及AS斑塊VV增生的影響
　　離體主動(dòng)脈環(huán)出芽實(shí)驗(yàn)表明，與Control組相比，TXL-L、TXL-M、TXL-H組小鼠主動(dòng)脈環(huán)出芽的數(shù)量和新生血管的長(zhǎng)度均顯著減少。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，利用Tomato lectin灌注后，以免疫組織化學(xué)染色法

10、顯示血管內(nèi)皮，與Control組相比，TXL-L、TXL-M、TXL-H組AS斑塊外膜的VV增生均顯著受到抑制。
　　結(jié)論：
　　1.TXL干預(yù)抑制VV增生可能是其抑制AS早期病變的形成及改善斑塊組織成分的作用機(jī)制之一;
　　2.TXL干預(yù)抑制VV增生的作用可能與調(diào)節(jié)斑塊內(nèi)血管新生因子的表達(dá)有關(guān);
　　3.TXL干預(yù)對(duì)血管新生因子的調(diào)控可能與抑制PI3K/Akt/HIF-1α信號(hào)通路有關(guān)。
　　Ⅱ通心絡(luò)抑制

11、動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展期斑塊炎癥性血管新生的作用及其機(jī)制研究
　　背景：
　　動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是大、中動(dòng)脈血管壁的一種慢性、全身炎癥反應(yīng)性疾病的概念已被人們廣泛接受。炎癥反應(yīng)貫穿AS病變發(fā)展的各個(gè)時(shí)期:在脂質(zhì)條紋形成早期，活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌趨化因子及表達(dá)粘附分子招募循環(huán)中單核細(xì)胞遷移、浸潤(rùn)至內(nèi)皮細(xì)胞下成為定居的巨噬細(xì)胞;斑塊內(nèi)活化的炎癥細(xì)胞分泌金屬基質(zhì)蛋白酶(matrix metallopr

12、oteinase，MMPs)降解細(xì)胞外基質(zhì)和纖維帽，導(dǎo)致斑塊破裂及血栓形成進(jìn)而引起臨床不良事件的發(fā)生。
　　多年來(lái)炎癥對(duì)AS斑塊進(jìn)展的研究多集中于其介導(dǎo)的固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，而近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明炎癥在斑塊內(nèi)血管新生增加AS斑塊易損性的過(guò)程中扮演著重要角色。AS易損斑塊的病理組織學(xué)特征為大的偏心脂質(zhì)核心、薄的纖維帽、活躍的炎癥反應(yīng)、血管正性重構(gòu)、斑塊內(nèi)大量血管新生及滋養(yǎng)血管(vasa vasorum，VV)增生等。近期的

13、影像學(xué)研究表明，在發(fā)生急性冠脈綜合征的病例中大多伴有近期內(nèi)斑進(jìn)展速率增加的現(xiàn)象。斑塊迅速增大的可能機(jī)制為:1)未導(dǎo)致臨床心血管事件的斑塊的反復(fù)破裂與修復(fù);2）斑塊內(nèi)新生血管的滲漏導(dǎo)致富含膽固醇的紅細(xì)胞膜在斑塊內(nèi)堆積及炎癥加劇;3）斑塊內(nèi)新生血管的破裂導(dǎo)致斑塊體積增大、膽固醇積聚和氧化應(yīng)激加劇。
　　在本論文第一部分的研究中，我們發(fā)現(xiàn)早期應(yīng)用中藥通心絡(luò)(Tongxinluo，TXL)能夠通過(guò)調(diào)節(jié)斑塊內(nèi)血管新生相關(guān)因子的表達(dá)抑制斑塊外

14、膜VV增生進(jìn)而抑制早期斑塊的形成，但是TXL對(duì)斑塊內(nèi)已經(jīng)形成的VV增生和進(jìn)展期斑塊內(nèi)血管新生以及炎性狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞血管新生能力的影響仍不明確。
　　因此，本研究擬在高脂喂養(yǎng)的載脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E deficient，apoE-/-)小鼠AS進(jìn)展期斑塊模型中，觀察TXL對(duì)進(jìn)展期斑塊內(nèi)炎癥性血管新生及斑塊穩(wěn)定性的影響，并在體外實(shí)驗(yàn)中探究TXL溶液對(duì)炎癥因子TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞血管新生的影響及可能的作

15、用機(jī)制。
　　目的：
　　1.觀察TXL對(duì)apoE-/-小鼠AS進(jìn)展期斑塊中已經(jīng)形成的VV增生、斑塊內(nèi)血管新生及斑塊穩(wěn)定性的影響;
　　2.觀察TXL溶液對(duì)炎性狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞血管新生的影響;
　　3.探討TXL干預(yù)影響炎癥性血管新生的可能機(jī)制。
　　方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立和分組
　　100只10周齡雄性apoE-/-小鼠，高脂飲食20周后，隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組(Control，n=

16、25)，TXL低劑量組(TXL-L，0.38g/kg/d，n=25)，TXL中劑量組(TXL-M，0.75g/kg/d，n=25)和TXL高劑量組(TXL-H，1.5g/kg/d，n=25);Control組給予相同體積的生理鹽水。所有apoE-/-小鼠全程高脂飲食，TXL干預(yù)16周后，小鼠行安樂(lè)死，留取各組小鼠血液及組織標(biāo)本。
　　2.血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè)
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)束末，檢測(cè)各組小鼠血清甘油三酯（triglycerides，T

17、G）、總膽固醇(totalcholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇酯(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇酯（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）以及血糖水平。
　　結(jié)果：
　　1.各組小鼠一般狀況觀察
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，共有10只小鼠死亡，其中Control組小鼠死亡3只，TXL-L組死亡3只

18、，TXL-M組及TXL-H組各死亡2只。小鼠體重在各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，血脂四項(xiàng)以及血糖水平在四組小鼠間均未有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.TXL干預(yù)對(duì)斑塊外膜滋養(yǎng)血管增生及斑塊內(nèi)血管新生的影響
　　與Control組相比，TXL各劑量干預(yù)組均能夠顯著減少斑塊外膜VV增生及斑塊內(nèi)血管新生，并且這一抑制作用呈劑量依賴(lài)性。
　　結(jié)論：
　　1.進(jìn)展期斑塊中炎癥及血管新生因子的高表達(dá)可能是促進(jìn)斑塊血管新生的主要機(jī)制;