基于多組學(xué)數(shù)據(jù)的代謝綜合征及代謝組分相關(guān)遺傳變異的探索和解析.pdf

1、代謝綜合征是一組代謝指標(biāo)異常癥侯群，主要表現(xiàn)為中心性肥胖、高血壓和糖脂代謝紊亂。研究表明，代謝綜合征會增加心腦血管疾病、糖尿病的發(fā)病風(fēng)險。按中國糖尿病協(xié)會定義，2010年我國居民代謝綜合征患病率達(dá)17.6％。雙生子研究表明，遺傳因素在代謝異常的發(fā)生中起了重要的作用。
　　經(jīng)典的全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study, GWAS)已發(fā)現(xiàn)了一些與代謝異常相關(guān)的遺傳變異，但仍存在以下兩大問題:(1)

2、已發(fā)現(xiàn)的位點僅能解釋少量的遺傳度，即存在大量丟失的遺傳度(missing heritability)有待進(jìn)一步探究;(2)以往研究主要關(guān)注表型相關(guān)的標(biāo)簽SNP(tag SNP)及與之距離最近的基因，但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，大部分的定位信號并不通過與之距離最近的基因起作用，如現(xiàn)已證明，定位在FTO上的肥胖相關(guān)位點主要通過遠(yuǎn)程調(diào)控IRX3基因表達(dá)影響表型?？傊?，以往對GWAS定位信號的解析非常有限，多數(shù)關(guān)鍵基因和效應(yīng)位點(causalvariant

3、)未被找到，不利于后續(xù)功能研究。
　　近些年研究發(fā)現(xiàn)，大部分表型相關(guān)遺傳變異通過調(diào)控基因表達(dá)水平進(jìn)而影響表型。若以基因表達(dá)調(diào)控作為注釋，可以將全基因組的篩選范圍縮小到基因表達(dá)數(shù)量性狀基因座(expression Quantitative Trait Loci，eQTLs)上，提高發(fā)現(xiàn)表型相關(guān)位點的效率。ENCODE、GTEx、Roadmap等研究項目陸續(xù)公布了大量可用于注釋遺傳變異對表型調(diào)控路徑中多個組學(xué)的信息，包括具有組織特異性

4、的基因表達(dá)、DNA甲基化、組蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。這些信息可用于進(jìn)一步精確篩選表型相關(guān)遺傳變異，也可用于對已知信號的重新解析。
　　以往的研究主要以歐裔人群為主，在我國漢族人群中的研究還很有限，由于不同人種間存在遺傳背景的差異，歐裔人群的研究結(jié)果不能直接外推至中國漢族人群。為了系統(tǒng)地探索代謝綜合征及代謝組分相關(guān)的遺傳易感位點，本研究以我國漢族人群為主要研究對象，通過基于多組學(xué)注釋的全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)并解析代謝異常相關(guān)的遺傳

5、變異。研究內(nèi)容分為三個部分（圖1）:
　　第一部分采用經(jīng)典的全基因組關(guān)聯(lián)分析策略，篩選與代謝綜合征及代謝組分關(guān)聯(lián)信號最強(qiáng)的遺傳變異位點并進(jìn)行多階段驗證、功能分析和基因環(huán)境交互效應(yīng)分析。
　　第二部分在第一部分研究的基礎(chǔ)上，通過對轉(zhuǎn)錄調(diào)控的注釋，進(jìn)一步篩選與糖脂代謝相關(guān)的遺傳變異，通過精細(xì)定位和功能實驗，解析基本調(diào)控路徑。
　　第三部分針對已知的糖脂代謝關(guān)聯(lián)信號，利用最新的多組學(xué)注釋信息對信號區(qū)域進(jìn)行系統(tǒng)化的重解析，探究

6、關(guān)鍵的調(diào)控基因，為關(guān)聯(lián)分析的成果轉(zhuǎn)化提供支持。
　　圖1研究內(nèi)容示意圖左上側(cè)圖為課題組開展的代謝綜合征GWAS關(guān)聯(lián)信號（P值）的曼哈頓圖，圖下左側(cè)為第一部分技術(shù)路線，右側(cè)為第二部分技術(shù)路線。右側(cè)圖為NHGRI-EBI GWAS catalog記錄的表型相關(guān)的位點，為研究的第三部分，采用多組學(xué)注釋，對與代謝異常相關(guān)的位點進(jìn)行系統(tǒng)化重解析。
　　第一部分代謝綜合征的遺傳易感性研究
　　一、研究目的:
　　在中國漢族人

7、群中篩選并驗證代謝綜合征相關(guān)的遺傳易感性位點。
　　二、材料和方法:
　　以單核苷酸多態(tài)性位點為遺傳變異標(biāo)記，首先在杭州蕭山地區(qū)1742例樣本中采用全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法，篩選出與代謝綜合征及代謝組分關(guān)聯(lián)信號最強(qiáng)的位點，然后對這些位點進(jìn)行多階段獨立樣本驗證，驗證樣本來自我國東部、北部、東北部等多個地區(qū)，共計10978例。合并多階段驗證結(jié)果后，對達(dá)到全基因組陽性水平的位點進(jìn)行功能預(yù)測、基因環(huán)境交互效應(yīng)分析。
　　三、研究

8、結(jié)果:
　　通過代謝綜合征的全基因組關(guān)聯(lián)分析及多階段獨立樣本的驗證，研究發(fā)現(xiàn)位于APOA5上的rs651821位點和位于ALDH2上亞洲人特有的高頻錯義突變位點rs671的基因型與代謝綜合征的遺傳易感性相關(guān)。在控制了APOA基因簇區(qū)域內(nèi)最強(qiáng)信號rs651821后，位于BUD13上的rs180326位點仍然與血清甘油三酯(triglyceride，TG)水平相關(guān)(Pcombined=2.4E-08)，是APOA基因簇內(nèi)一個新的第二信

9、號(secondary signal)。在整合了遺傳變異位點rs651821、rs180326、血清APOA5、BUD13的蛋白水平、TG水平后分析發(fā)現(xiàn)，除了APOA5外，BUD13也參與了血清TG水平的調(diào)控。此外，研究發(fā)現(xiàn)rs671位點的多態(tài)性不僅會通過影響乙醛代謝影響人們的飲酒行為，該位點還與飲酒行為之間存在對代謝綜合征及相關(guān)代謝表型的交互效應(yīng)，其效應(yīng)主要存在于飲酒人群中。
　　四、小結(jié):
　　(1)在中國漢族人群中，r

10、s651821(APOA5)和rs671(ALDH2)位點的基因型與代謝綜合征的遺傳易感性相關(guān);
　　(2) rs180326(BUD13)基因型與血清TG水平相關(guān)，其效應(yīng)獨立于已知位點rs651821(APOA5);
　　(3) rs671(ALDH2)的基因型與飲酒行為存在交互效應(yīng)。
　　第二部分基于注釋信息的糖脂代謝相關(guān)遺傳變異篩選及精細(xì)定位
　　一、研究目的:
　　在第一部分研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合多組學(xué)

11、注釋信息，進(jìn)一步篩選和驗證糖脂代謝指標(biāo)相關(guān)的遺傳變異位點;對新發(fā)現(xiàn)的糖脂代謝相關(guān)遺傳變異位點進(jìn)行精細(xì)定位，并通過功能實驗確認(rèn)效應(yīng)位點。
　　二、材料和方法:
　　首先，通過對1742例樣本（同第一部分）的糖脂代謝的全基因組關(guān)聯(lián)分析，得到與表型相關(guān)的但又未被第一部分驗證過的遺傳變異位點;然后分析這些位點與脂肪、肝臟、胰島和骨骼肌中基因表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)，并將這些位點的信號與表型關(guān)聯(lián)信號共定位，找出與糖脂代謝表型相關(guān)的eQTLs;進(jìn)

12、一步通過多階段獨立樣本驗證基因型與表型的關(guān)聯(lián);對驗證達(dá)到全基因組陽性水平的位點，通過以基因為單位的分析策略(gene-based analyses)推測其可能的調(diào)控基因;并通過ENCODE和Roadmap計劃提供的相關(guān)組織細(xì)胞中染色質(zhì)狀態(tài)、組蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合信號推測調(diào)控活性區(qū)域及其對應(yīng)的效應(yīng)位點;最后構(gòu)建包含不同等位基因的載體，通過熒光素酶報告基因?qū)嶒灤_認(rèn)其表達(dá)調(diào)控作用。
　　三、研究結(jié)果:
　　通過全基因組關(guān)聯(lián)分析及

13、eQTL的注釋，發(fā)現(xiàn)了22個與糖脂代謝相關(guān)的遺傳變異位點在特定的組織中影響基因表達(dá)，多階段獨立樣本驗證確認(rèn)了rs1880118位點與血清HDL-C水平的關(guān)聯(lián)(Pcombined=1.4E-10)。該位點可以tag的區(qū)域主要包括DAGLB和RAC1兩個基因，在加性模型下，rs1880118的基因型可以解釋DAGLB(diacylglycerol lipase，beta)基因在皮下脂肪組織中表達(dá)水平變異的47.7％(P=5.9E-42)。同

14、時，通過TWAS、SMR、Sherlock等以基因為單位的研究方法，我們發(fā)現(xiàn)DAGLB基因與血清HDL-C水平之間存在關(guān)聯(lián)，關(guān)聯(lián)的P值分別為3.0E-08、1.1E-04和1.6E-06。進(jìn)一步通過組蛋白信號H3K27ac、H3K4me3，H3K9ac及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域、DNA酶Ⅰ超敏位點的定位，找到了位于DAGLB基因5'區(qū)域的調(diào)控活性片段，熒光素酶報告基因的結(jié)果顯示，該活性片段中rs4724806位點（與rs1880118位點LD

15、r2=0.77）可能是真正的效應(yīng)位點，其最小等位基因會增加轉(zhuǎn)錄活性，與eQTL分析的結(jié)果一致。
　　四、小結(jié):
　　rs1880118是一個在中國漢族人群中新發(fā)現(xiàn)的與血清HDL-C水平相關(guān)的遺傳變異位點，其效應(yīng)位點rs4724806通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性影響DAGLB基因表達(dá)，該部分研究提示了DAGLB基因在脂代謝中的作用。
　　第三部分利用多組學(xué)注釋系統(tǒng)解析糖脂代謝相關(guān)的遺傳變異
　　一、研究目的:
　　結(jié)合多

16、組學(xué)注釋信息，對已知的糖脂代謝相關(guān)遺傳變異信號區(qū)域進(jìn)行系統(tǒng)的解析，探究基因型到表型的調(diào)控路徑，為后續(xù)功能研究提供支持。
　　二、研究方法:
　　首先，整理已報道的與糖脂代謝相關(guān)的遺傳變異位點;然后，利用千人基因組計劃提供的位點間連鎖不平衡信息，填補(bǔ)出所有與lead SNP高度連鎖不平衡的位點用于后續(xù)的精細(xì)定位和功能預(yù)測;接著，對這些位點進(jìn)行系統(tǒng)的多組學(xué)注釋，包括基因表達(dá)、染色質(zhì)狀態(tài)、DNA甲基化、組蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。

17、對位于編碼區(qū)域的遺傳變異位點，再進(jìn)行物種間保守性估計、翻譯后修飾等翻譯水平的注釋;最后，整理推測出可能的基因型到表型調(diào)控路徑。
　　三、研究結(jié)果:
　　對經(jīng)篩選過濾后得到的592個糖脂代謝相關(guān)遺傳變異位點進(jìn)行填補(bǔ)后，共計17646個位點納入后續(xù)精細(xì)定位分析(LD r2＞0.5)。在轉(zhuǎn)錄水平，通過遺傳變異與基因表達(dá)相關(guān)的注釋，發(fā)現(xiàn)了104個在內(nèi)臟脂肪、肝臟、骨骼肌或胰島細(xì)胞中與基因表達(dá)水平相關(guān)的位點。同時，發(fā)現(xiàn)了一些與特定環(huán)境

18、刺激相關(guān)的eQTLs，如rs702485位點與DAGLB基因表達(dá)的關(guān)聯(lián)僅出現(xiàn)在LPS刺激后(Pbefore＞0.05，Pafter=2.52E-16)。133個糖脂代謝相關(guān)位點與脂肪組織或胰島細(xì)胞中的DNA甲基化相關(guān)，其中許多位點與多個CpG位點的甲基化水平相關(guān)。經(jīng)過對遺傳變異位點的精細(xì)定位，我們發(fā)現(xiàn)有49個位點可以關(guān)聯(lián)(tag)到一個或以上的位于組蛋白修飾信號峰區(qū)域內(nèi)的位點，且具有組織特異性。在翻譯水平，有122個（r2＞0.5）或4

19、3個(r2＞0.8)位點可以關(guān)聯(lián)到一個或以上的非同義突變位點，其中有16個位點經(jīng)SIFT和Polyphen注釋均提示存在影響蛋白功能的可能。對糖代謝相關(guān)位點rs1535500精細(xì)定位和功能預(yù)測后發(fā)現(xiàn)，該位點G到T的變異與附近7個CpG位點的存在相關(guān)聯(lián)，這些位點靠近KCNK17基因5'端的CpG島，存在影響DNA甲基化的可能。通過對胰島細(xì)胞中多個組學(xué)的信息整合，發(fā)現(xiàn)該位點確實可以通過影響附近位點甲基化水平進(jìn)而影響KCNK17的表達(dá)，這不同

20、于以往報道認(rèn)為該信號主要通過KCNK16起作用。
　　四、小結(jié):
　　(1)通過整合多個組學(xué)信息，對糖脂代謝GWAS信號進(jìn)行重新解析后發(fā)現(xiàn)了許多可能參與到遺傳變異影響表型調(diào)控路徑中的基因及調(diào)控元件。與其他復(fù)雜表型類似，經(jīng)過注釋后，三分之一的基因與以往對該位點報道一致。
　　(2)僅有7％-20％的糖脂代謝表型相關(guān)遺傳變異位點可以關(guān)聯(lián)到一個或以上的非同義或無義突變，其余可能通過轉(zhuǎn)錄水平影響表型。
　　(3)通過對糖

21、代謝相關(guān)的位點rs1535500的精細(xì)定位，發(fā)現(xiàn)該位點G到T的變異與附近位點CpG位點的存在相關(guān)聯(lián)，進(jìn)而影響甲基化水平調(diào)控KCNK17的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　基于以上三部分內(nèi)容，得出以下結(jié)論:
　　(1)在中國漢族人群中，rs651821(APOA5)和rs671(ALDH2)位點的基因型與代謝綜合征的遺傳易感性相關(guān);新發(fā)現(xiàn)的rs180326(BUD13)位點與血清TG水平的關(guān)聯(lián)獨立于區(qū)域內(nèi)已知位點rs651821;

22、rs671與飲酒行為存在交互效應(yīng)。
　　(2)結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控注釋信息可優(yōu)化GWAS的篩選策略;rs1880118是一個在中國漢族人群中新發(fā)現(xiàn)的與血清HDL-C水平相關(guān)的遺傳變異位點，與該位點高度連鎖不平衡的rs4724806位點多態(tài)性會通過調(diào)控DAGLB基因表達(dá)影響表型。
　　(3)80％以上的糖脂代謝相關(guān)位點主要通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平影響表型;經(jīng)多組學(xué)注釋推測的調(diào)控基因中有三分之一與原GWAS報道的基因一致，如文獻(xiàn)報道糖代謝相關(guān)位