冬眠誘導(dǎo)因子對大鼠深低溫停循環(huán)腦保護作用的研究.pdf

1、深低溫停循環(huán)(deep hypothermic circulatory arrest，DHCA)的研究和應(yīng)用始于上世紀(jì)50年代。1975年，Griepp在進行主動脈弓部手術(shù)時開始使用深低溫停循環(huán)以降低腦代謝，滿足手術(shù)時循環(huán)停止的安全時限，這一技術(shù)給予了外科醫(yī)生清晰的視野及有效的操作空間，體外循環(huán)及深低溫停循環(huán)從此成為心臟外科處理復(fù)雜先心病、主動脈及弓部置換等復(fù)雜手術(shù)時常用的技術(shù)之一。雖然深低溫停循環(huán)手術(shù)的成功率及并發(fā)癥的發(fā)生隨技術(shù)及設(shè)備

2、的發(fā)展已得到明顯改善，但神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥仍居高不下。據(jù)報道，5.4％的患者在深低溫停循環(huán)后出現(xiàn)永久性神經(jīng)功能障礙癥狀[1]，而25％的患者在術(shù)后可發(fā)生短暫性神經(jīng)功能障礙[2]。在兒童中神經(jīng)功能障礙發(fā)生率更高[3]。神經(jīng)功能障礙嚴(yán)重影響了心臟外科患者的臨床后果及國家醫(yī)療資源的使用。
　　心臟外科深低溫停循環(huán)患者神經(jīng)功能障礙的發(fā)生機制可能與以下因素有關(guān):缺血、再灌注損傷、低氧、炎癥、血液稀釋及低溫等因素。這些因素可以導(dǎo)致細(xì)胞Na+-K+

3、-ATP酶失活，細(xì)胞內(nèi)鈉離子儲留，細(xì)胞膜電位去極化，鈣離子通道激活、內(nèi)流增加，促進自由基生成等引起神經(jīng)細(xì)胞損傷甚至壞死。選擇性腦灌注雖然在臨床中廣泛使用，但較深低溫停循環(huán)相比并未明顯降低腦部并發(fā)癥的發(fā)生[4]。而逆行性腦灌注被認(rèn)為能更好的維持腦部均衡低溫以及沖出腦血管的栓塞，然而研究顯示其較單獨深低溫停循環(huán)或選擇性順行性腦灌注并未見明顯臨床優(yōu)勢，其短暫性神經(jīng)功能障礙發(fā)生率反而高于順行性腦灌注患者，中風(fēng)等永久性神經(jīng)功能障礙的發(fā)生也未見差異

4、[5]。如何預(yù)防神經(jīng)功能障礙發(fā)生、選擇更好的神經(jīng)功能保護方法仍是心臟外科基礎(chǔ)研究的關(guān)鍵及臨床中亟待解決的問題。
　　冬眠(torpor or hibernation)是一個生態(tài)學(xué)概念，是冬眠動物在面對不適宜環(huán)境時進化出的特殊技能，以代謝率降低，體溫下降為主要標(biāo)志，進而在一個低水平狀態(tài)下維持能量供需平衡。冬眠過程中心率及心輸出量極度下降，可降至活躍期的1-2％，冬眠動物經(jīng)歷了嚴(yán)重長期的低溫及缺血再灌注過程，卻不會發(fā)生任何形式的神經(jīng)功

5、能障礙。因此，我們選擇使用金花松鼠(chipmunk)這一真正儲食型冬眠動物及SD大鼠(rat)作為實驗對象。實驗共分三部分，第一部分使用金花松鼠及大鼠分別建立體外循環(huán)深低溫停循環(huán)模型，驗證金花松鼠作為儲食型冬眠動物是否可以抵抗60分鐘深低溫停循環(huán)過程并探索其可能涉及的保護機制;第二部分誘導(dǎo)金花松鼠進入冬眠過程，試圖發(fā)現(xiàn)其冬眠的啟動因素，并嘗試探索其血液內(nèi)是否存在與活躍期表達(dá)差異蛋白并予以提取純化，將此蛋白應(yīng)用于活躍期金花松鼠中是否可以

6、誘導(dǎo)其進入冬眠，推測此蛋白是否與冬眠啟動過程相關(guān);第三部分，將此蛋白應(yīng)用于大鼠，建立大鼠深低溫停循環(huán)模型，驗證該蛋白是否可以保護大鼠抵抗深低溫停循環(huán)導(dǎo)致的腦損傷，并探討其保護機制是否與δ-阿片類受體及BDNF-TrkB-P75NTR及SIRT1-P53通路相關(guān)。
　　一:金花松鼠抵抗深低溫停循環(huán)腦損傷的機制研究
　　目的:冬眠動物可以自然的進入冬眠過程，這一過程伴隨著極低的機體代謝率、低溫以及其他生理狀態(tài)的改變。金花松鼠是一

7、種真正的冬眠動物，它可以在冬眠過程中抵抗極低的腦血流和低溫導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。深低溫停循環(huán)是心臟外科處理主動脈弓部病變或復(fù)雜先天性心臟病時常用的技術(shù)手段，然而這一技術(shù)仍伴隨著較高的神經(jīng)并發(fā)癥發(fā)生率。本研究旨在探討活躍期金花松鼠與SD大鼠相比是否可以抵抗DHCA導(dǎo)致的腦損傷以及是否BDNF-TrkB-P75NTR通路在這一神經(jīng)保護機制中發(fā)揮作用。
　　方法:活躍期金花松鼠及SD大鼠各20只，隨機分別分為chipmunk組、chi

8、pmunkDHCA組、rat組以及ratDHCA組，每組10只動物。Chipmunk DHCA組及rat DHCA組行體外循環(huán)及60分鐘DHCA，chipmunk組與rat組僅進行插管不進行體外循環(huán)及DHCA。再灌注3小時及24小時后，抽取血樣測量腫瘤壞死因子α（tumor necrosisfactor alpha, TNF-α）以及白介素6（interleukin-6，IL-6）。再灌注24小時后，取大鼠及金花松鼠海馬測量δ1-阿片類

9、受體(Opioid Receptor Delta1，OPRD1)、成熟腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(mature brain-derived neurotrophic factor, mature BDNF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子前體(pro-BDNF)、全長酪氨酸激酶受體B(Tropomyosin receptor kinaseB-Full length，TrkB-FL)、截斷酪氨酸激酶受體B(truncated TrkB，TrkB-T1)、生長

10、因子受體結(jié)合蛋白2(growth factor receptor-bound protein2，GRB2)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶類(extracellular regulated protein kinases，Erk)、p-Erk、P38、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B cell lymphoma2，Bcl-2)、p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體(p75 neurotrophin receptor,P75NTR)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TNF r

11、eceptor associated factor6，TRAF6)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、P53、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2associatedXprotein，Bax)以及cleaved caspase3蛋白表達(dá)。再灌注24小時后，取大鼠及金花松鼠大腦固定染色進行病理評估。
　　結(jié)果:金花松鼠與SD大鼠比較有很強的抵抗DHCA導(dǎo)致的缺血再灌注損傷能力。在ratDH

12、CA組中，再灌注后3h及24h，TNF-α以及IL-6水平均明顯高于chipmunkDHCA組（P＜0.05）。在chipmunk DHCA組中，海馬中的OPRD1、matureBDNF/pro-BDNF、TrkB-FL/TrkB-T1、Bcl-2、p-Erl/Erk均高于ratDHCA組，而GRB2、P75NrR、TRAF6、JNK、P53、Bax以及Caspase3均低于rat DHCA組。病理評估顯示了ratDHCA組中大腦損傷較

13、chipmunk DHCA組嚴(yán)重（P＜0.05）。
　　結(jié)論:實驗證實了金花松鼠在活躍期可以極大的耐受DHCA導(dǎo)致的腦損傷。不同的BDNF亞型水平及其下游通路可能參與抵御DHCA導(dǎo)致的損傷。金花松鼠可以作為研究保護DHCA腦損傷的新模型，更好的理解金花松鼠的保護機制可以為臨床DHCA患者提供新的神經(jīng)保護機制，改善臨床后果。
　　二:冬眠誘導(dǎo)因子提取純化
　　目的:誘導(dǎo)金花松鼠冬眠，提取純化冬眠期金花松鼠血液內(nèi)與非冬眠期

14、金花松鼠血液內(nèi)差異蛋白。
　　方法:30只雄性金花松鼠，于2016年3月購買于室溫20攝氏度環(huán)境飼養(yǎng)，9月份隨機依次將20只金花松鼠轉(zhuǎn)移至4攝氏度低溫環(huán)境中誘導(dǎo)冬眠，其余仍置于20攝氏度環(huán)境中飼養(yǎng)。每日測量溫度及監(jiān)測活動和進食。金花松鼠于深冬眠過程后頸動脈穿刺置管，采集血液后處死?；钴S期金花松鼠于2016年7月同法采集血液處死。血液離心取上清，親和層析柱分離蛋白，蛋白經(jīng)透析及凍干后再次溶解，使用非變性聚丙烯酰胺凝膠(native-

15、PAGE)電泳，考馬斯亮藍(lán)染色觀察不同蛋白表達(dá)差異，切取差異蛋白條帶，考馬斯亮藍(lán)洗脫液洗脫，使用水平電泳以及PAGE膠蛋白微量回收試劑盒回收凝膠內(nèi)蛋白，再次透析凍干，對活躍期金花松鼠注射提取蛋白驗證活性。
　　結(jié)果:金花松鼠冬眠期與非冬眠比較，離心后獲得總血清量分別為31.41ml和15.8ml，親和層析法提取蛋白量分別為1135mg及472mg，考馬斯亮藍(lán)染色可見不同條帶蛋白表達(dá)差異，其中80kD及40kD左右可見冬眠期出現(xiàn)新的

16、表達(dá)蛋白，而活躍期可見55kD左右蛋白表達(dá)增加，使用膠回收試劑盒回收40kD蛋白，獲得363mg特異蛋白，連續(xù)三天靜脈注射30mg/kg40kD蛋白可使金花松鼠進入類似冬眠狀態(tài)，注射0.3mg/kg納洛酮可以阻斷其進入類冬眠狀態(tài)。
　　結(jié)論:冬眠金花松鼠血清內(nèi)具有特異蛋白質(zhì)并可誘導(dǎo)非冬眠期金花松鼠進入類冬眠狀態(tài)，可能與冬眠啟動相關(guān)。
　　三冬眠誘導(dǎo)因子對大鼠深低溫停循環(huán)腦保護作用的研究
　　目的:探討冬眠誘導(dǎo)因子(Hi

17、bernation Induced Trigger, HIT)是否可以保護SD大鼠抵抗深低溫停循環(huán)導(dǎo)致的腦損傷以及BDNF-TrkB-P75NTR通路及SIRT1-P53通路是否在冬眠誘導(dǎo)因子對大鼠深低溫停循環(huán)的腦保護機制中發(fā)揮作用。
　　方法:SD大鼠40只，隨機分為sham組、DHCA組、DHCA+HIT組及DHCA+HIT+naloxone組。對照組不接受體外循環(huán)，后3組進行體外循環(huán)及60分鐘深低溫停循環(huán)。術(shù)后3小時及24小

18、時抽血測量TNF-α及IL-6;24小時后連續(xù)7天行水迷宮實驗及空間探索實驗監(jiān)測神經(jīng)功能;8天后取大鼠腦組織，行Western B1ot分析OPRD1、mature BDNF、pro-BDNF、TrkB-FL、TrkB-T1、GRB2、Erk、p-Erk、P38、p-P38、Bcl-2、P75NTR、TRAF6、JNK、p-JNK、P53、Ac-P53、Bax、SIRT1以及cleavedcaspase3蛋白表達(dá)，測量各組海馬中MDA及

19、SOD水平，并行HE染色，Nissl染色及TUNEL染色進行大鼠腦組織損傷病理評估。
　　結(jié)果:HIT可以顯著減輕DHCA導(dǎo)致的腦損傷，減輕炎癥反應(yīng)，改善DHCA后神經(jīng)功能。術(shù)后3h及24h，DHCA+HIT組中TNF-α及IL-6水平明顯低于DHCA組（P＜0.05）及DHCA+HIT+naloxone組（P＜0.05），但高于sham組(P＜0.05)。DHCA8天后OPRD1水平各組比較無明顯差異(P＞0.05)，m-BDN

20、F, TrkB-FL，TrkB-FL/TrkB-T1,p-Erk/Erk,GRB2,Bcl-2,SIRT1及mBDNF/proBDNF在DHCA+HIT組中高于DHCA組(P＜0.05)、DHCA+HIT+naloxone組（P＜0.05），但低于sham組(P＜0.05)。DHCA+HIT組中TrkB-T1、p-P38/P38、P75NTR、TRAF6、p-JNK/JNK、P53、Ac-P53、Bax和cleaved caspase3

21、表達(dá)均低于DHCA組(P＜0.05)和DHCA+HIT+naloxone組（P＜0.05），但高于sham組（P＜0.05）。SOD及MDA水平在DHCA+HIT組、DHCA組及DHCA+HIT+naloxone組無差異，MDA水平高于sham組(P＜0.05)，SOD水平低于sham組(P＜0.05)。病理染色顯示神經(jīng)細(xì)胞損傷及凋亡在DHCA+HIT組中受到抑制，DHCA組中神經(jīng)損傷最重。水迷宮實驗證實HIT可以有效的增加DHCA后神