miR-1207-5p對(duì)食管鱗癌發(fā)生的影響.pdf

1、背景：
　　食管癌是我國(guó)較常見的惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)，屬第六大最常見的癌癥，癌癥死亡的第五大原因，主要分為兩大亞型：食管鱗狀細(xì)胞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma，ESCC）和食管腺癌（Esophageal Adenocarcinoma，EAC），西方國(guó)家食管癌以EAC為主，而 ESCC在發(fā)展中國(guó)家較為普遍。目前對(duì)食管癌的治療仍以手術(shù)切除，輔以放化療的方法。受檢測(cè)方法等因素限制，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)

2、時(shí)已屬中晚期，傳統(tǒng)的治療方法不能有效延長(zhǎng)患者的生存期，因此從基因和分子水平探討食管癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制，顯得尤為必要和迫切。
　　MicroRNAs(miRNAs)是一類大小約20-24 nt的非編碼微小RNA，在生物中廣泛存在，并通過(guò)與靶標(biāo)基因mRNA上的3'端非翻譯區(qū)（3' untranslational region，3'-UTR）種子區(qū)域特異結(jié)合對(duì)靶基因?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，或者維持靶基因的穩(wěn)定性。近年來(lái)的研究顯示，miRNA通過(guò)與靶

3、基因的3'-UTR結(jié)合從而抑制特定的癌基因或抑癌基因，其作用類似抑癌基因或癌基因，參與腫瘤細(xì)胞的生成、轉(zhuǎn)移、侵潤(rùn)及上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)化等多種生物學(xué)過(guò)程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，目前 miRNA在腫瘤中的研究己成為一個(gè)新熱點(diǎn)。miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控是21世紀(jì)的一個(gè)里程碑似的科學(xué)發(fā)現(xiàn)。
　　多項(xiàng)研究證實(shí) miRNAs在食管癌中的重要性和潛在應(yīng)用前景，多個(gè)抑制或促進(jìn)食管癌進(jìn)程的miRNAs被發(fā)現(xiàn)，如miR-21、miR

4、-205、miR-203、miR-145、let7、miR-196a等。miR-1207-5p位于染色體8q24，由非編碼基因PVT1產(chǎn)生，與其同家族的還有miR-1204、miR-1205、miR-1206和miR-1208，PVT1是多種類型癌癥的一個(gè)潛在的致癌基因。該家族的miR-1204和miR-1206均發(fā)現(xiàn)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。在包括乳腺癌、胃癌和腸癌多種腫瘤以及干燥綜合征、慢性腎衰竭等疾病中發(fā)現(xiàn)miR-1207-5p異常

5、表達(dá)并與疾病的惡性程度密切相關(guān)，然而它在食管癌中的表達(dá)和作用尚未有研究報(bào)道。本課題主要包括：1.探討miR-1207-5p在食管鱗癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)，以及與疾病的相關(guān)性；2.調(diào)控miR-1207-5p表達(dá)水平對(duì)食管鱗癌細(xì)胞株EC9706和EC-1的生物學(xué)影響；3.初步探討miR-1207-5p靶基因及抑制腫瘤的可能機(jī)制。研究目的在于探討miR-1207-5p對(duì)食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的影響，以期為食管鱗癌的診斷和防治提供理論依據(jù)。
　　

6、材料與方法：
　　第一部分 miR-1207-5p在食管鱗癌組織中的異常表達(dá)及其與臨床病理特征相關(guān)性
　　1、收集49例ESCC臨床標(biāo)本及其匹配的癌旁組織。
　　2、取3例ESCC中心組織及其匹配癌旁組織行Agilent miRNA芯片檢測(cè)，分析miRNA的差異性表達(dá)，篩選出上調(diào)或下調(diào)的miRNA。
　　3、TRIzol法提取組織總RNA并檢測(cè)RNA質(zhì)量；qRT-PCR法分別驗(yàn)證上調(diào)的miRNA3個(gè)(miR-21

7、-5p，miR-138和miR-196a-5p)；下調(diào)的miRNA3個(gè)(miR-133a，miR-495和miR-1207-5p)；
　　4、根據(jù)miR-1207-5p在組織中的表達(dá)水平，分析miR-1207-5p表達(dá)水平與患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、腫瘤定位、性別和年齡等之間的關(guān)系。
　　5、檢測(cè)5種鱗癌細(xì)胞株和正常食管上皮細(xì)胞中miR-1207-5p的表達(dá)水平。
　　第二部分 miR-1207-5p對(duì)食管鱗癌細(xì)

8、胞生物學(xué)行為的影響
　　1、合成miR-1207-5p模擬物(mimics)和對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照（NC）后，通過(guò)脂質(zhì)體LipofectamineTM2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染鱗癌細(xì)胞株EC9706和EC-1。
　　2、應(yīng)用CCK-8（Cell Counting Kit-8）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖變化。
　　3、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的侵襲力。
　　4、AnnexinV-FITC/PI法和Hoechst333

9、42/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡。PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期變化。
　　5、合成經(jīng)修飾過(guò)的miR-1207-5p模擬物(agomir)和對(duì)應(yīng)的NC后，通過(guò)脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染鱗癌細(xì)胞 EC9706，接種裸鼠皮下，檢測(cè)miR-1207-5p在體內(nèi)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。
　　第三部分 miR-1207-5p與STOML-2的靶向關(guān)系研究
　　1、通過(guò) TargetScan(www.targetscan.org)和

10、miRDB(www.mirdb.org)在線預(yù)測(cè)miR-1207-5p的靶基因，STOML-2（Stomatin-like protein2）為其潛在靶基因。
　　2、檢測(cè)49例鱗癌中心組織及其匹配癌旁組織的STOML-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平，并與miR-1207-5p在組織中的表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　3、檢測(cè)5種鱗癌細(xì)胞中的STOML-2蛋白水平。
　　4、通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證靶基因。將 STOM

11、L-23'-UTR的野生型（WT）和突變型（MT）序列插入 pmirGLO載體構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒 pmirGLO-STOML-2-3'-UTR-WT/MT；然后將其與 miR-1207-5p mimics或 NC共轉(zhuǎn)染 HEK293T細(xì)胞，分別檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性；以驗(yàn)證STOML-2是否為 miR-1207-5p的靶基因。
　　5、將miR-1207-5p mimics或NC轉(zhuǎn)染食管鱗癌細(xì)胞株EC9706和EC-1

12、，WB檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)STOML-2蛋白表達(dá)情況。
　　6、運(yùn)用小 RNA干擾技術(shù)降低鱗癌細(xì)胞中 STOML-2的表達(dá)，同時(shí)構(gòu)建缺失3'-UTR的表達(dá)真核表達(dá)載體pcDNA3.1-STOML-2上調(diào)鱗癌細(xì)胞中STOML-2的表達(dá)，觀察其表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲的影響；在細(xì)胞中利用表達(dá)載體pcDNA3.1-STOML-2上調(diào)STOML-2表達(dá)，同時(shí)在細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-1207-5p mimics或 NC，觀察細(xì)胞增殖和侵襲的變化，并分析 S

13、TOML-2是否阻斷miR-1207-5p對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲力的抑制作用。
　　7、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行，數(shù)據(jù)以X±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)和ANOVA。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性檢驗(yàn)用Spearman分析，以α=0.05為顯著性水準(zhǔn)。
　　結(jié)果
　　第一部分 miR-1207-5p在食管鱗癌組織中的異常表達(dá)及其與臨床病理特征相關(guān)性
　　1、在檢測(cè)的3例鱗癌中心組織

14、中，芯片篩選出上調(diào)表達(dá)的miRNAs18個(gè)，下調(diào)表達(dá)的miRNAs40個(gè)。
　　2、經(jīng) qRT-PCR驗(yàn)證的6個(gè) miRNAs(miR-21-5p，miR-138，miR-196a-5p，miR-133a，miR-495和miR-1207-5p)，表達(dá)均與芯片結(jié)果一致，其中miR-1207-5p為下調(diào)表達(dá)。
　　3、49例食管鱗癌中心組織與其匹配癌旁組織中，81.6％(40/49)的鱗癌患者腫瘤組織中miR-1207-5p表

15、達(dá)水平較癌旁對(duì)照組織降低；差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；統(tǒng)計(jì)分析表明：miR-1207-5p表達(dá)水平下降與腫瘤分化程度有相關(guān)性（P<0.01）；與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分期均有相關(guān)性（P<0.01）。但與腫瘤定位、性別和年齡無(wú)關(guān)（P>0.05)。
　　4、5種鱗癌細(xì)胞中miR-1207-5p的水平較正常上皮細(xì)胞低(P<0.05)。
　　第二部分 miR-1207-5p對(duì)食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　1、轉(zhuǎn)染 miR-1

16、207-5p mimics至食管鱗癌細(xì)胞株 EC9706和EC-1后，與對(duì)照組比較，EC9706細(xì)胞內(nèi)miR-1207-5p表達(dá)水平為34.20±3.86，EC-1細(xì)胞內(nèi)miR-1207-5p表達(dá)水平為18.81±3.17，表達(dá)水平上調(diào)，差異顯著（P<0.01）
　　2、與轉(zhuǎn)染miR-1207-5p NC組相比，miR-1207-5p mimics組細(xì)胞增殖率在48h后出現(xiàn)顯著抑制（P<0.05)；
　　3、轉(zhuǎn)染miR-12

17、07-5p mimics后，EC9706和EC-1兩種細(xì)胞穿過(guò)基質(zhì)膜的數(shù)量分別為43.6±6.19和39.2±4.70，與對(duì)照組比較顯著降低（P<0.05)。
　　4、在轉(zhuǎn)染 miR-1207-5p mimics的細(xì)胞中，EC9706細(xì)胞凋亡率為（11.33±1.01)%，NC組為（6.31±0.54)%，P<0.05；EC-1細(xì)胞凋亡率為（7.92±0.98)%，NC組為（4.88±0.53)%，P<0.05。
　　5、B

18、lank、NC和miR-1207-5p mimics各轉(zhuǎn)染組中，G0/G1期細(xì)胞比例在EC9706細(xì)胞中分別為54.84%,54.15%和66.85%；在EC-1細(xì)胞中分別為56.29%,55.96%和67.14%，miR-1207-5p mimics組細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例顯著增高，差異具有顯著性（P<0.05）；而 S期細(xì)胞比例減少（EC9706：29.44%,31.15%和21.60%；EC-1：31.21%,32.14%和17

19、.16%）。
　　6、裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)顯示：miR-1207-5p agomir組腫瘤體積顯著低于 miR-1207-5p對(duì)照組腫瘤體積（P<0.05)，并且腫瘤生長(zhǎng)速度減緩。
　　第三部分 miR-1207-5p與STOML-2的靶向關(guān)系研究
　　1、TargetScan和miRDB均預(yù)測(cè)STOML-2為miR-1207-5p的靶基因之一。
　　2、檢測(cè)49例食管鱗癌中心組織與其匹配癌旁組織，發(fā)現(xiàn)STOML-2 m

20、RNA和蛋白在癌組織中均表達(dá)升高，而miR-1207-5p在癌組織中表達(dá)水平降低，相關(guān)性分析表明：miR-1207-5p和STOML-2在組織中存在負(fù)相關(guān)（R2=0.73）。
　　3、5種鱗癌細(xì)胞株中STOML-2蛋白表達(dá)高于正常食管上皮細(xì)胞。
　　4、共轉(zhuǎn)染 miR-1207-5p mimics和pmirGLO-STOML-2-3'-UTR-WT重組載體時(shí)，細(xì)胞螢光素酶基因活性顯著降低（P<0.01）；而同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-1

21、207-5p mimics和pmirGLO-STOML-2-3'-UTR-MT重組載體時(shí)，細(xì)胞螢光素酶基因活性無(wú)顯著變化。
　　5、在EC9706和EC-1細(xì)胞中，WB結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-1207-5p mimics的細(xì)胞中，STOML-2蛋白表達(dá)水平顯著抑制（P<0.05）；提示miR-1207-5p mimics可以與STOML-2的3'-UTR結(jié)合并抑制其表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證STOML-2為miR-1207-5p

22、的靶基因。
　　6、在EC9706和EC-1細(xì)胞中，運(yùn)用RNAi技術(shù)降低STOML-2的表達(dá)后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖和侵襲力顯著降低（P<0.05）。
　　7、在EC9706和EC-1細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染無(wú)3'-UTR的pcDNA3.1-STOML-2表達(dá)載體組，STOML-2蛋白表達(dá)水平與未轉(zhuǎn)染組比較，顯著升高。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)表明：與對(duì)照組比較，該組細(xì)胞穿過(guò)基質(zhì)膜的細(xì)胞數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與共轉(zhuǎn)染miR-

23、1207-5p mimics和無(wú)3'-UTR的pcDNA3.1-STOML-2組比較，該轉(zhuǎn)染組細(xì)胞穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)量無(wú)顯著性改變（P>0.05）。結(jié)果顯示： miR-1207-5p是通過(guò)結(jié)合STOML-2基因的3'-UTR而調(diào)控其表達(dá)的；上調(diào)STOML-2表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn) miR-1207-5p對(duì)鱗癌細(xì)胞侵襲的抑制作用。
　　結(jié)論：
　　1、食管鱗癌組織中共篩選獲得18個(gè)上調(diào)表達(dá)的miRNAs，40個(gè)下調(diào)表達(dá)的miRNAs。

24、miR-1207-5p在食管鱗癌組織中低表達(dá)，并且miR-1207-5p的表達(dá)水平與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤進(jìn)程和TNM分期相關(guān)。
　　2、上調(diào)miR-1207-5p表達(dá)能夠?qū)?xì)胞增殖和侵襲起抑制作用，而對(duì)細(xì)胞的凋亡則起促進(jìn)作用；miR-1207-5p過(guò)表達(dá)能夠減緩腫瘤生長(zhǎng)速度，縮小腫瘤體積。
　　3、STOML-2為 miR-1207-5p的靶基因，miR-1207-5p可通過(guò)結(jié)合STOML-2的3'-UTR而調(diào)節(jié)其蛋白表達(dá)