人類NK細(xì)胞新功能基因HMBOX1的發(fā)現(xiàn)及其對(duì)NK細(xì)胞功能的調(diào)節(jié).pdf

1、研究目的：
　　 人類基因組計(jì)劃于1990年啟動(dòng)，旨在對(duì)人體23對(duì)染色體全部DNA的堿基對(duì)(約30億)序列進(jìn)行排序、對(duì)功能基因進(jìn)行染色體定位、構(gòu)建人類基因組遺傳圖譜和物理圖譜。該計(jì)劃于2006年全面完工，歷時(shí)16年繪制出了一本精確的人類基因圖譜。根據(jù)基因組圖譜推算，人的基因總數(shù)有近4萬，截止到目前為止被發(fā)現(xiàn)和得到功能闡明的只有2-3萬左右，其中還有近一半功能未知。人類基因圖譜這一海量信息庫的建立為新功能基因的發(fā)現(xiàn)和研究提供了很好

2、的研究機(jī)遇和平臺(tái)。后基因組時(shí)代的組學(xué)研究從傳統(tǒng)的“蛋白找基因”模式，漸漸轉(zhuǎn)向了以“圖譜找基因”，再研究蛋白功能為主要特征的反向生物學(xué)模式。例如，科研工作者們應(yīng)用生物信息學(xué)方法建立基因全長ORF文庫，從中篩選新功能基因；采用分子生物學(xué)方法建立組織特異性cDNA文庫；通過比較生物學(xué)方法尋找正常組織或參與癌癥等重大疾病發(fā)生的特異性基因，并利用這些資源建立起一些高通量篩選新功能基因的方法。其中，細(xì)胞水平的功能基因篩選和功能研究是被廣泛應(yīng)用的方法

3、之一，是將含有基因過表達(dá)或敲除序列的載體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞系中，通過細(xì)胞的表型和功能變化來篩選新功能基因，并研究基因具體功能和作用機(jī)制。所以建立合適的細(xì)胞篩選平臺(tái)對(duì)新功能基因的發(fā)現(xiàn)十分重要。
　　 NK細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中和T、B細(xì)胞并列的第三大淋巴細(xì)胞，屬于天然免疫系統(tǒng)的重要成員。NK細(xì)胞在機(jī)體中不僅具有清除腫瘤和病毒感染細(xì)胞的功能，而且可以引發(fā)和調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答，參與特殊組織器官的免疫耐受狀態(tài)，以及抑制移植免疫排斥等。NK細(xì)胞與T細(xì)胞

4、由共同的祖細(xì)胞發(fā)育而來，但和T細(xì)胞的研究相比，NK細(xì)胞的發(fā)育、分化、功能調(diào)節(jié)等研究領(lǐng)域還存在許多空白。
　　 目前的理論認(rèn)為，NK細(xì)胞的活化是由表面活化性受體和抑制性受體的協(xié)調(diào)平衡調(diào)控的，尤其是NKG2D和NKG2A之間的平衡關(guān)系。大量文獻(xiàn)報(bào)道NKG2D及其配體在腫瘤免疫逃逸和炎癥發(fā)生中有重要作用，使NKG2D在NK細(xì)胞的基礎(chǔ)研究和NK細(xì)胞與疾病的研究領(lǐng)域備受關(guān)注。多方面因素可以引起NKG2D分子表達(dá)變化，但NKG2D分子在細(xì)胞

5、內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制卻尚未見報(bào)道。
　　 本研究中，我們建立了以NK細(xì)胞系為基礎(chǔ)的天然免疫功能基因篩選平臺(tái)，候選基因是由北京中國國家人類基因組北方研究中心贈(zèng)送，含有158個(gè)功能未知基因的cDNA文庫。我們通過NK細(xì)胞的功能實(shí)驗(yàn)從中篩選出對(duì)NK細(xì)胞功能有影響的新的功能基因，并選定其中一個(gè)人轉(zhuǎn)錄因子HMBOX1為重點(diǎn)研究對(duì)象，并對(duì)其在NK細(xì)胞中的表達(dá)水平及功能進(jìn)行了研究。
　　 研究方法：
　　 首先，經(jīng)過多種NK細(xì)胞轉(zhuǎn)

6、染方法比較，我們選擇電轉(zhuǎn)方法將候選基因過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入NK細(xì)胞系NK-92細(xì)胞中，建立穩(wěn)定的過表達(dá)細(xì)胞株；通過MTT增殖實(shí)驗(yàn)和Cr51釋放殺傷實(shí)驗(yàn)的初步篩選，獲得多個(gè)候選基因；然后，利用流式細(xì)胞技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)，分析NK細(xì)胞表面分子和NK細(xì)胞殺傷相關(guān)分子表達(dá)水平的變化，從cDNA文庫中篩選出對(duì)NK細(xì)胞功能有影響的候選基因。
　　 在明確HMBOX1為重點(diǎn)研究對(duì)象后，首先構(gòu)建HMBOX1的全長表達(dá)載體pcDNA3.1-HMBOX

7、1-myc/his，將其通過電穿孔的方法轉(zhuǎn)入NK細(xì)胞系NK-92和NKL，經(jīng)G418篩選建立穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株，再用MTT法測(cè)其增殖變化和NK細(xì)胞殺傷功能；通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)反映NK細(xì)胞脫顆粒能力的CD107a分子表達(dá)水平；PCR方法檢測(cè)NK細(xì)胞殺傷相關(guān)分子和細(xì)胞因子，包括顆粒酶(Grazyme)、穿孔素(Perforin)、IFN-γ、TNF-α、NKG2A、NKG2D和DAP10的mRNA表達(dá)水平；通過流式檢測(cè)NK細(xì)胞表面分子NKG2

8、D、NKG2A、CD54、NKp46、TRAIL和Fas ligand的表達(dá)水平；用K562細(xì)胞或NKG2D抗體交聯(lián)活化NK細(xì)胞后，通過流式細(xì)胞術(shù)或ELISA方法檢測(cè)IFN-γ、TNF-α和穿孔素的表達(dá)水平；用慢病毒負(fù)載的shRNA干擾NK細(xì)胞中HMBOX1的表達(dá)，反向證明HMBOX1與NKG2D的關(guān)系；通過Western blot方法檢測(cè)NKG2D/DAP10信號(hào)通路重要蛋白PI3K(p85，p55)、ERK1/2和PLCγ2的磷酸化

9、水平，及HMBOX1、NKG2D和DAP10的蛋白表達(dá)水平；應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)研究HMBOX1對(duì)IFN-γ啟動(dòng)子序列的調(diào)控。
　　 對(duì)于HMBOX1在NK細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控研究，我們首先通過PCR方法比較多種造血系統(tǒng)細(xì)胞系之間，以及外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)和NK細(xì)胞(primary NK)中HMBOX1基因的表達(dá)水平，采用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心的方法從健康人外周血中分離PBMC，再用磁珠分選的方法分離NK細(xì)胞。用RT

10、-qPCR的方法分別檢測(cè)HMBOX1在IL-2、IL-15、IL-12和IFN-α刺激活化的NK細(xì)胞中的表達(dá)情況，從中發(fā)現(xiàn)HMBOX1與NK細(xì)胞功能狀態(tài)之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果一：基于NK細(xì)胞的天然免疫功能基因篩選平臺(tái)的建立
　　 1、基于生物信息學(xué)的系統(tǒng)性RT-PCR/ORFome庫的建立由國家人類基因組北方研究中心采用反向基因組學(xué)方法構(gòu)建。
　　 2、158個(gè)候選基因cDNA表達(dá)載體的擴(kuò)增和鑒定候選基因表達(dá)質(zhì)

11、粒分別轉(zhuǎn)化受體菌種擴(kuò)增，提取質(zhì)粒后進(jìn)行PCR和限制性內(nèi)切酶鑒定。
　　 3、候選基因過表達(dá)NK-92細(xì)胞株的建立轉(zhuǎn)染NK-92細(xì)胞方法的選擇及條件摸索，大規(guī)模NK-92基因過表達(dá)細(xì)胞株的建立及穩(wěn)定篩選。
　　 4、候選基因的初步篩選轉(zhuǎn)基因NK-92細(xì)胞的增殖能力及殺傷活性檢測(cè)。
　　 5、候選基因的鑒定檢測(cè)轉(zhuǎn)基因NK-92細(xì)胞的免疫表型變化及功能基因mRNA表達(dá)水平。
　　 結(jié)果二：人轉(zhuǎn)錄因子HMBOX1

12、對(duì)NK細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用。
　　 1、HMBOX1過表達(dá)載體的構(gòu)建從NK-92細(xì)胞中調(diào)取HMBOX1基因全長，構(gòu)建過表達(dá)載體pcDNA3.1-HMBOX1-myc/his，并通過Western blot對(duì)重組載體的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。
　　 2、HMBOX1基因過表達(dá)細(xì)胞株的建立及增殖能力檢測(cè)通過電穿孔的方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入NK-92和NKL細(xì)胞系，篩選建立穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株，對(duì)其增殖能力進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)無明顯變化。
　　 3

13、、過表達(dá)HMBOX1基因抑制NK細(xì)胞的殺傷活性殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)HMBOX1顯著抑制了NK-92和NKL細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞系HepG2和K562的殺傷能力，NK細(xì)胞的脫顆粒能力也顯著下降，進(jìn)一步證實(shí)了HMBOX1對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性有明顯的抑制作用。
　　 4、過表達(dá)HMBOX1抑制NK細(xì)胞殺傷分子表達(dá)過表達(dá)HMBOX1顯著抑制了NK細(xì)胞胞內(nèi)Perforin和GZM K、GZM H的mRNA水平以及Perforin的蛋白水平表達(dá)

14、。
　　 5、過表達(dá)HMBOX1抑制NK細(xì)胞促炎癥細(xì)胞因子分泌過表達(dá)HMBOX1抑制NK細(xì)胞中IFN-γ和TNF-α的mRNA表達(dá)水平及蛋白分泌水平。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)HMBOX1抑制IFN-γ啟動(dòng)子活性。
　　 6、HMBOX1負(fù)調(diào)節(jié)殺傷活化性受體NKG2D的表達(dá)過表達(dá)HMBOX1抑制NKG2D蛋白在NK細(xì)胞中的表達(dá)，而對(duì)其他殺傷相關(guān)受體影響不明顯。RNA干擾HMBOX1基因后促進(jìn)NKG2D的表達(dá)與NK細(xì)胞的殺傷

15、能力。
　　 7、HMBOX1負(fù)調(diào)節(jié)NKG2D/DAP10信號(hào)通路活化HMBOX1抑制NK細(xì)胞NKG2D/DAP10信號(hào)通路PI3K(p85，p55)、ERK1/2和PLCγ2的磷酸化水平，及NKG2D和DAP10的蛋白表達(dá)水平，但NKG2D和DAP10的mRNA水平無顯著變化。
　　 結(jié)果三：HMBOX1基因在細(xì)胞因子活化的人外周血NK細(xì)胞中的表達(dá)分析
　　 1、HMBOX1基因在原代NK細(xì)胞中高表達(dá)新鮮分離的

16、人外周血NK細(xì)胞中HMBOX1表達(dá)水平比人NK細(xì)胞系高出近90倍。
　　 2、細(xì)胞因子活化的原代NK細(xì)胞中HMBOX1的表達(dá)水平檢測(cè)IL-2、IL-15和IL-12下調(diào)原代NK細(xì)胞中HMBOX1基因的表達(dá)；IFN-α上調(diào)原代NK細(xì)胞中HMBOX1的表達(dá)。
　　 結(jié)論及意義：
　　 首先，本研究建立了基于NK細(xì)胞的天然免疫功能基因篩選平臺(tái)。根據(jù)NK細(xì)胞的生物學(xué)功能，以NK細(xì)胞增殖能力和對(duì)靶細(xì)胞的殺傷功能作為初步篩選

17、指標(biāo)，然后利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)候選基因進(jìn)行全面分析，包括NK細(xì)胞表面分子和殺傷相關(guān)分子的表達(dá)水平，從中選出兩個(gè)對(duì)NK細(xì)胞功能有影響的新功能基因，并對(duì)其中的一個(gè)HMBOX1基因進(jìn)行深入研究。
　　 通過對(duì)HMBOX1在NK細(xì)胞中的具體功能進(jìn)行了深入研究發(fā)現(xiàn)，HMBOX1可以負(fù)向調(diào)節(jié)NK細(xì)胞表面活化受體NKG2D的表達(dá)，降低NKG2D/DAP10信號(hào)通路的活化水平，同時(shí)抑制殺傷相關(guān)分子Perforin和GZM K、GZM H的表達(dá)及

18、IFN-γ、TNF-α的分泌水平，從而抑制NK細(xì)胞的活化和殺傷能力。這些結(jié)果證明，HMBOX1分子對(duì)NK細(xì)胞功能起負(fù)調(diào)節(jié)作用。
　　 基于上述研究，我們進(jìn)一步研究HMBOX1在靜息和細(xì)胞因子活化的人外周血NK細(xì)胞中表達(dá)特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：HMBOX1在靜息的人外周血NK細(xì)胞中表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于體外培養(yǎng)的NK細(xì)胞系，而在IL-2、IL-15和IL-12活化的人外周血NK細(xì)胞中HMBOX1均被下調(diào)，提示HMBOX1在NK細(xì)胞中發(fā)揮穩(wěn)態(tài)作用