2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
已閱讀1頁,還剩136頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

1、本文主要從以下幾方面進行論述:
  第一章 空卵泡綜合征致病突變的定位研究
  目的:空卵泡綜合征(EFS)是指在促排卵周期或自然周期中,超聲監(jiān)測下卵泡大小、數(shù)目及血清雌激素水平均在正常范圍,但經(jīng)反復(fù)抽吸、沖洗均無法獲得卵母細(xì)胞。目前臨床上對于反復(fù)發(fā)生EFS的患者尚無有效助孕方法,為獲得妊娠,這部分不孕女性只能借助于供卵。關(guān)于EFS的發(fā)病機制至今尚未明確,有研究者認(rèn)為與卵泡提早閉鎖、卵巢老化等因素有關(guān)。對于EFS的遺傳學(xué)發(fā)病

2、機制,既往研究包括LHCGR基因突變和2號染色體倒位,但均為單個病人或單個小家系的研究,缺少令人信服的大家系研究。筆者前期收集了一個有六個不孕癥患者的大家系(家系Ⅰ),先證者及其姐姐的各三個體外助孕周期獲得的卵冠丘復(fù)合物幾乎全部為空黏液團,僅極少數(shù)存在退變的卵母細(xì)胞,表現(xiàn)為EFS;先證者的兩個姑姑與兩個堂姐妹也同樣為不明原因不孕癥患者。本章研究擬通過此大家系,定位EFS的致病突變。
  方法:為明確EFS的致病基因,首先對家系Ⅰ進

3、行全基因組連鎖分析,找到連鎖不平衡區(qū)域。該家系為常染色體顯性遺傳,致病突變由父親傳遞。為進一步明確致病突變,選擇家系Ⅰ中的三個患者、兩個突變攜帶者和兩個正常女性對照進行全外顯子組測序。對全外顯子組測序數(shù)據(jù)進行生物信息分析并對候選位點進行驗證、常用數(shù)據(jù)庫過濾和正常生育女性對照過濾。將最終篩選出的位點在另一個EFS大家系(家系Ⅱ)和EFS散發(fā)病人中驗證,并追溯攜帶此突變的散發(fā)病人的家族史,明確變異的來源。最后綜合上述結(jié)果,得到導(dǎo)致EFS的致

4、病突變位點。
  結(jié)果:經(jīng)全基因組連鎖分析發(fā)現(xiàn)該家系的連鎖不平衡區(qū)域位于7p12.3-q21.13。全外顯子組測序結(jié)果經(jīng)過生物信息分析及驗證、常用數(shù)據(jù)庫和正常生育女性對照中過濾后,得到候選位點:ZP3 c.400 G>A(p.Ala134Thr)雜合錯義突變。該突變位于家系Ⅰ的連鎖不平衡區(qū)域中,與疾病狀態(tài)共分離。在家系Ⅱ中,該突變亦與疾病狀態(tài)共分離。經(jīng)連鎖分析證實,在這兩個大家系中,此突變?yōu)楠毩l(fā)生,不存在同源性。在21例EFS散

5、發(fā)病例中,有2例攜帶同一位點相同的突變,追溯家族史發(fā)現(xiàn)其中一位患者的突變?yōu)樾掳l(fā)突變(de novo)。
  結(jié)論:本研究是EFS的首個大家系研究,通過兩個EFS大家系和EFS散發(fā)病例研究發(fā)現(xiàn)ZP3 c.400 G>A(p.Ala134Thr)雜合錯義突變可能為EFS的致病突變。本研究也為EFS提供了潛在的診斷靶點:對于取卵呈現(xiàn)空黏液團無法獲卵的不孕癥患者可早期進行ZP3 c.400 G>A的突變篩查,若患者攜帶此突變,則應(yīng)避免反復(fù)

6、促排卵嘗試,盡早轉(zhuǎn)換助孕策略,從而減輕患者的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)和精神壓力,獲得更好的助孕結(jié)局。
  第二章 致病突變的體外功能研究
  目的:ZP3基因編碼的ZP3糖蛋白是卵母細(xì)胞透明帶的重要組分。透明帶是包繞卵母細(xì)胞的結(jié)構(gòu),是卵母細(xì)胞的“外衣”,在卵母細(xì)胞發(fā)育、受精及早期胚胎發(fā)育過程中起到重要的作用。p.Ala134Thr突變位于ZP3的ZP功能域,ZP功能域在透明帶組裝過程中發(fā)揮重要的作用。本章將通過體外實驗對p.Ala134Th

7、r進行功能研究。
  方法:首先通過卵母細(xì)胞免疫熒光染色和卵巢活檢組織石蠟切片染色等方法,對空卯泡綜合征患者卵母細(xì)胞的具體異常進行表征。用PyMol軟件預(yù)測突變對ZP3糖蛋白分子三維結(jié)構(gòu)的影響。隨后通過構(gòu)建野生型、突變型表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)染至中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO-K1)中,裂解細(xì)胞獲得總蛋白,利用免疫共沉淀技術(shù)探究突變型蛋白對蛋白互作的影響。
  結(jié)果:家系Ⅰ先證者穿刺取卵獲得的絕大多數(shù)為空黏液團,極少數(shù)包含無透明帶的退變卵

8、母細(xì)胞。免疫熒光顯示卵母細(xì)胞核物質(zhì)完全崩解,且卵外周無ZP3信號聚集。卵巢活檢石蠟切片示卵泡中的卵母細(xì)胞無透明帶結(jié)構(gòu)且呈退變狀態(tài)。免疫共沉淀實驗證實野生型ZP3可與ZP2結(jié)合,突變型ZP3不與ZP2結(jié)合,但野生型、突變型ZP3同時存在時,突變型ZP3通過與野生型ZP3結(jié)合以阻止野生型ZP3與ZP2的結(jié)合,發(fā)揮顯性負(fù)效應(yīng)的作用,妨礙透明帶的形成。
  結(jié)論:p.Ala134Thr突變發(fā)揮顯性負(fù)效應(yīng)的作用,抑制ZP3與ZP2的結(jié)合,妨

9、礙透明帶的形成,引起卵母細(xì)胞退變,表現(xiàn)為空卵泡綜合征。
  第三章 致病突變的小鼠模型研究
  目的:透明帶的結(jié)構(gòu)在哺乳動物中具有很高的保守性。小鼠透明帶由Zp1、Zp2、Zp3基因編碼的糖蛋白構(gòu)成,由Zp2和Zp3相互連接成纖維狀結(jié)構(gòu),Zp1連接這些纖維構(gòu)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在既往的報道中,Zp3基因敲除小鼠完全不孕,超數(shù)排卵實驗獲得的卵冠丘復(fù)合物大多為空黏液團,少數(shù)取到的卵母細(xì)胞無透明帶,這與本研究中空卵泡綜合征患者的表型極

10、為相似。人和小鼠的ZP3均包含424個氨基酸,氨基酸序列同源性達(dá)67%。除外小鼠、大鼠等嚙齒類動物,ZP3糖蛋白的第134位氨基酸位點在各物種中均為丙氨酸(Ala)。小鼠Zp3糖蛋白在此位點為性質(zhì)與丙氨酸類似的纈氨酸(Val)。因此,在構(gòu)建點突變小鼠模型時,我們將小鼠Zp3基因一條鏈突變?yōu)樘K氨酸(Thr),另一條鏈保持不變,仍為纈氨酸,即獲得p.Val134Thr小鼠。本章將對p.Val134Thr點突變小鼠進行研究,進一步驗證該突變的

11、功能。
  方法:利用CRISPR-Cas9編輯的“類精子細(xì)胞”單倍體細(xì)胞系制備p.Val134Thr點突變小鼠,與性成熟的野生型雄鼠合籠觀察生育力;對21天的小鼠行超數(shù)排卯,統(tǒng)計獲卯?dāng)?shù);分別取21天和6周齡小鼠卵巢組織脫水、石蠟包埋,對組織切片行HE染色、ZP3免疫組織化學(xué)(IHC)和過碘酸-雪夫染色(PAS),觀察組織切片中各級卵泡中卯母細(xì)胞的形態(tài)。
  結(jié)果:p.Val134Thr點突變純合小鼠完全不孕,雜合子小鼠生育

12、力與野生型相比雖略有降低,但無統(tǒng)計學(xué)差異。超數(shù)排卵實驗中,雜合子、純合子小鼠獲卵數(shù)與野生型小鼠相比均存在顯著差異。雜合子小鼠獲卵數(shù)約為野生型小鼠的1/2-2/3,卵母細(xì)胞透明帶比野生型小鼠薄;純合子小鼠絕大部分的卵冠丘復(fù)合物為空黏液團,少數(shù)獲得的卵母細(xì)胞無透明帶且大小不一,為退變裂解卵。卵巢切片HE、IHC、PAS染色示雜合子小鼠卵母細(xì)胞形態(tài)大致正常,但透明帶相比于野生型小鼠略薄;純合小鼠卵母細(xì)胞缺乏透明帶。
  結(jié)論:p.Val

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論