熊果酸通過PPARα-γ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路改善KKAy小鼠胰島素抵抗的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　 胰島素抵抗是指胰島素效應(yīng)器官或部位對正常數(shù)量的胰島素作用不敏感的一種病理生理狀態(tài)，現(xiàn)主要是指外周靶器官對胰島素介導(dǎo)的葡萄糖代謝作用不敏感的狀態(tài)，是滋生多種代謝性疾病的共同危險(xiǎn)因素，且往往存在于疾病的早期階段。因此，對胰島素抵抗進(jìn)行干預(yù)和治療，對防治各種代謝性疾病特別是2 型糖尿病有重要意義。
　　 肥胖（主要是腹型肥胖）是胰島素抵抗發(fā)生、發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素。肥胖可以通過內(nèi)分泌、脂肪細(xì)胞因子、炎性反應(yīng)和細(xì)

2、胞內(nèi)在信號通路導(dǎo)致胰島素抵抗。過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）是調(diào)節(jié)目標(biāo)基因表達(dá)的核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄因子超家族成員。
　　 PPAR 具有多種生物學(xué)效應(yīng)，可促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化、增強(qiáng)機(jī)體對胰島素的敏感性、調(diào)節(jié)體內(nèi)糖平衡、抑制炎癥因子生成及炎癥形成、影響腫瘤生長、對心血管產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)。脂肪分解產(chǎn)生的游離脂肪酸和脂肪細(xì)胞因子常常參與肥胖介導(dǎo)的胰島素抵抗發(fā)生。
　　 肥胖，PPAR受體以及胰島素抵抗三者間通過各種活性因子形成了一種

3、復(fù)雜的制約關(guān)系，其中PPAR的不同受體類型（如PPARα和PPARγ）在生物活性上的差異又在很大程度上打破或維持這種平衡。正如PPAR γ單純激動劑在改善胰島素抵抗治療2 型糖尿病的同時(shí)也帶來了脂肪增多的問題，PPARα單純激動劑在改善血脂的情況下卻難以降低血糖。因此，尋找一種能夠較好維持PPARs 受體激動效力的藥物，可能是解決這一問題的關(guān)鍵。
　　 祖國醫(yī)學(xué)在長期的臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)大量治療和改善胰島素抵抗的藥物及復(fù)方，其中以中

4、醫(yī)“酸入肝”、“酸勝甘”為理論指導(dǎo)，擬制的酸味中藥復(fù)方具有較好的改善血糖血脂且不增加體重的功效。我們前期的研究已發(fā)現(xiàn)，酸味中藥復(fù)方的重要活性物質(zhì)——熊果酸，具有與PPAR α和PPAR γ結(jié)合的化學(xué)特性，且有調(diào)節(jié)其下游信號通路中關(guān)鍵蛋白的作用。
　　 因此，我們提出熊果酸可能是通過恰當(dāng)激活了PPAR α和PPAR γ達(dá)到上述功效的。
　　 我們將通過細(xì)胞和動物實(shí)驗(yàn)，利用分子生物學(xué)手段，以胰島素抵抗重要的靶器官脂肪、肝臟和

5、肌肉為研究重點(diǎn)，在體外和體內(nèi)探索這一機(jī)制。
　　 研究目的:
　　 確定熊果酸是否能與PPARα和PPARγ受體結(jié)合以及比較其結(jié)合率與常用PPARα和PPARγ受體激動劑非諾貝特和羅格列酮的差異。觀察熊果酸對3T3-L1細(xì)胞胰島素抵抗模型PPAR α/γ下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路aP2、CAP、Perilipin、MMP-1表達(dá)變化的影響，探明其抑制脂肪分化的作用機(jī)制。觀察熊果酸對自發(fā)性2 型糖尿病KKA y小鼠糖、脂代謝的影響和

6、對KKA y小鼠血清中FFA，TNF-α，脂聯(lián)素含量，肝臟胰島素抵抗相關(guān)基因PEPCK、IRS-2及GLUT2表達(dá)及磷酸化，肌肉GLUT4 轉(zhuǎn)運(yùn)以及肝臟和肌肉組織中PPAR α、PPAR γ及GLUT4表達(dá)的影響，探討熊果酸改善自發(fā)性2 型糖尿病KKA y小鼠胰島素抵抗的機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 構(gòu)建PPAR α，PPAR γ表達(dá)質(zhì)粒及PPRE的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，用脂質(zhì)體將陽性對照PPAR α和PPAR γ以及

7、PPRE 調(diào)控的熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒分別與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，加入不同濃度的熊果酸、羅格列酮、非諾貝特，檢測雙重?zé)晒馑孛傅玫较鄬晒馑孛富钚?，其活性表示干預(yù)藥物對PPAR α和PPAR γ的激活強(qiáng)度。
　　 將3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞，再利用高糖/高胰島素液誘導(dǎo)建立3T3-L1細(xì)胞胰島素抵抗模型。以10-5 mol/L 熊果酸干預(yù)3T3-L1細(xì)胞胰島素抵抗模型，采用RT-PCR的方法檢測aP

8、2、CAP、Perilipin、MMP-1基因mRAN表達(dá)，Wes t en-bl ot法檢測aP2、CAP、Perilipin、MMP-1蛋白的表達(dá)及Perilipin的磷酸化水平。再利用PPAR α/γ阻斷劑與10-5 mol/L 熊果酸共同干預(yù)3T3-L1細(xì)胞胰島素抵抗模型觀察其對相關(guān)蛋白的影響。
　　 根據(jù)隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)方法將KKA y小鼠分為5組，分別設(shè)對照組，羅格列酮組，非諾貝特組，熊果酸高劑量組和熊果酸低劑量組，并以

9、C57小鼠作為正常對照，每組7只。
　　 干預(yù)4周后，檢測各組體重、肝重、腹腔脂肪重量、空腹血糖、空腹血清胰島素、血脂四項(xiàng)、葡萄糖耐量、肝糖原含量及糖異生的變化；計(jì)算肝臟指數(shù)、腹脂指數(shù)、胰島素抵抗指數(shù)；觀察各組肝組織（HE 染色）病理變化。
　　 應(yīng)用ELESA 法檢測血清中FFA、TNF-α、脂聯(lián)素含量；RT-PCR 方法檢測PEPCK、IRS-2及GLUT2基因mRAN表達(dá)；Westen-blot 法檢測PEPCK、

10、IRS-2及GLUT2表達(dá)和小鼠肌肉組織中GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)；免疫組化法觀察肝臟和肌肉組織中PPAR α、PPAR γ、GLUT4表達(dá)。
　　 研究結(jié)果:
　　 濃度為2×10-5 mol/L～2×10-7 mol/L 熊果酸、羅格列酮和非諾貝特可誘導(dǎo)PGL3-PPRE-Luc 轉(zhuǎn)錄激活，羅格列酮和非諾貝特分別對PPAR γ和PPAR α表達(dá)質(zhì)粒具有明顯轉(zhuǎn)錄激活作用(P<0.01)。而熊果酸在低濃度條件下對過表達(dá)PPAR

11、γ的HepG2細(xì)胞沒有明顯作用，在高濃度時(shí)對PPAR γ和PPAR α表達(dá)質(zhì)粒具有顯著轉(zhuǎn)錄激活作用(P<0.01)，其最高激動效力分別是羅格列酮和非諾貝特的38.6％和51.6％。
　　 熊果酸干預(yù)的3T3-L1細(xì)胞胰島素抵抗模型Perilipin 磷酸化表達(dá)明顯降低，與胰島素抵抗組有明顯差異（P<0.01）。CAPmRNA和蛋白表達(dá)明顯提高（P<0.01）。加入PPAR α/γ阻斷劑后對Perilipin和CAP的影響明顯減弱

12、，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　 熊果酸和羅格列酮能夠不同程度改善KKA y小鼠口服葡萄糖耐量，降低胰島素抵抗指數(shù)、增加肝糖原含量；熊果酸和非諾貝特均能降低KKA y小鼠體重、肝臟指數(shù)和腹脂指數(shù)、降低腹腔脂肪重量、改善血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 熊果酸組血清中FFA、TNF-α、脂聯(lián)素含量均有變化與對照組有顯著差異（P<0.01）；熊果酸對

13、肝臟中PEPCK表達(dá)及IRS-2的磷酸化影響與對照組比較有顯著差異（P<0.01）；熊果酸還可以改善肌肉組織中GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)和提高肝臟中PPARα的表達(dá)（P<0.01）。
　　 結(jié)論:
　　 （1）熊果酸在2×10-5 mol/L～2×10-6 mol/L濃度下在體外對PPAR γ和PPAR α均有一定激動作用，可能是一種PPAR α/γ較弱性的雙重激動劑。
　　 （2）熊果酸改善3T3-L1細(xì)胞胰島素抵抗模型