長(zhǎng)鏈非編碼RNA-LINC01116在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其腫瘤生物學(xué)功能與機(jī)制的研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占全部顱內(nèi)腫瘤的40％-65％，是顱內(nèi)腫瘤患者的主要死因之一。其中低級(jí)別膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后往往較好，10年的總體生存率可以達(dá)到47％左右，而絕大多數(shù)高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者預(yù)后較差，其中多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)的惡性程度最高，其5年的存活率甚至小于3％，明確診斷后的平均生存時(shí)間只有12月左右。盡管醫(yī)學(xué)界對(duì)膠質(zhì)瘤患者的治療已經(jīng)做出了巨大的努力，但是對(duì)膠質(zhì)瘤

2、患者的預(yù)后改善仍然較差。造成膠質(zhì)瘤治療效果欠佳的原因不僅包括腫瘤本身增長(zhǎng)迅速，血管密集，血運(yùn)豐富，對(duì)放化療的的耐受性，也包括腫瘤細(xì)胞向周?chē)ＤX組織侵潤(rùn)的特性。膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)非常復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，其中涉及到了非常多的基因和細(xì)胞生物學(xué)行為的改變，為提高膠質(zhì)瘤的治療效果，新的治療手段如基因靶向治療開(kāi)始興起并應(yīng)用于膠質(zhì)瘤的治療，然而目前臨床上應(yīng)用的藥物，如替莫唑胺、貝伐單抗等，在患者中的有效率仍然很低。因此，只有全面深入地了解膠質(zhì)瘤發(fā)

3、生發(fā)展的分子機(jī)制，才能為臨床對(duì)膠質(zhì)瘤的診治提供效率更高的分子靶向藥物和更為精準(zhǔn)的輔助診斷標(biāo)志物。
　　隨著基因測(cè)序、基因芯片和基因組學(xué)等研究技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)被發(fā)現(xiàn)參與到了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理生理過(guò)程中，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)展及疾病的發(fā)生過(guò)程中起到了重要的作用。長(zhǎng)鏈非編碼RNA的異常表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致一系列中樞系統(tǒng)疾病的發(fā)生，其對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的分化影響巨大。并且長(zhǎng)鏈

4、非編碼RNA在腦膠質(zhì)瘤病理生理過(guò)程中的重要作用也越來(lái)越被廣泛接受，其不僅可通過(guò)調(diào)控多種通路及與不同分子的相互作用來(lái)調(diào)控膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，且在膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)、分型和預(yù)后，及維持膠質(zhì)瘤細(xì)胞干性上都發(fā)揮了重要的作用。
　　因此本研究通過(guò)lncRNAs芯片，表達(dá)譜芯片等高通量篩選技術(shù)，篩選出在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用的長(zhǎng)鏈非編碼RNA分子LINC01116，并結(jié)合生物信息學(xué)分析及一系列經(jīng)典分子生物學(xué)技術(shù)等，在膠質(zhì)瘤臨床樣本

5、、體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞系、體內(nèi)裸鼠荷瘤模型中對(duì)LINC01116分子在膠質(zhì)瘤臨床樣本中的表達(dá)情況，以及其在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的所起到的具體的生物學(xué)功能及相關(guān)的分子機(jī)制進(jìn)行全面而深入的研究。通過(guò)本課題的研究，我們期待明確LINC01116在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的功能與機(jī)制，并明確其在膠質(zhì)瘤臨床診斷和評(píng)估預(yù)后上的作用，為膠質(zhì)瘤的診斷和預(yù)后提供新的標(biāo)志物，并為其作為潛在藥物作用靶點(diǎn)提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分:正常腦組織和腦膠質(zhì)瘤腫瘤

6、組織中長(zhǎng)鏈非編碼RNA與mRNA的芯片檢測(cè)和分析
　　研究目的:觀(guān)察在正常腦組織和膠質(zhì)瘤腫瘤組織中差異表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA分子和信使RNA(messenger RNA，mRNA)分子的表達(dá)變化情況，挑選關(guān)鍵的長(zhǎng)鏈非編碼RNA分子作為進(jìn)行深入研究的對(duì)象。
　　研究方法:收集2014年12月至2015年5月間在上海長(zhǎng)征醫(yī)院神經(jīng)外科收治并手術(shù)切除的5例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤臨床組織樣本和5例正常腦組織樣本，使用Arraystar人類(lèi)Lnc

7、RNA芯片V3.0芯片系統(tǒng)地檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA和信使RNA的表達(dá)，篩選差異倍數(shù)≥2的長(zhǎng)鏈非編碼RNA和信使RNA，并應(yīng)用配對(duì)t檢驗(yàn)計(jì)算長(zhǎng)鏈非編碼RNA和信使RNA在兩組間差異的顯著性，p≤0.05時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，最終取差異倍數(shù)≥2，且p≤0.05的長(zhǎng)鏈非編碼RNA和信使RNA，并隨機(jī)挑選12個(gè)分子采用實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)

8、在原5對(duì)正常腦組織和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本驗(yàn)證芯片數(shù)據(jù)的可靠性。利用生物信息學(xué)靶定與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA分子。
　　結(jié)果:共有4502條lncRNA和5492條mRNA在兩組樣品間表達(dá)差異明顯。其中2601條lncRNA和2693條mRNA表達(dá)上調(diào)，1901條lncRNA和2799條mRNA表達(dá)下調(diào)。qRT-PCR的結(jié)果提示挑選出的12個(gè)分子的表達(dá)與lncRNA和mRNA芯片結(jié)果的表達(dá)趨勢(shì)一致。其中長(zhǎng)鏈非編碼LINC

9、01116在腫瘤組織中顯著上調(diào)表達(dá)，提示它可能對(duì)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要作用。
　　結(jié)論:(1)通過(guò)基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，對(duì)比正常腦組織，在腦膠質(zhì)瘤組織中存在大量差異表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA和信使RNA，這些差異表達(dá)的分子可能與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展和遷移侵襲過(guò)程密切相關(guān)，為后續(xù)進(jìn)一步篩選與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵長(zhǎng)鏈非編碼RNA提供了基礎(chǔ)。(2) qRT-PCR驗(yàn)證了基因芯片的結(jié)果，證明lncRNA和mRNA芯片結(jié)果是可靠的。(3)生物信息

10、學(xué)分析靶定了可能在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用候選長(zhǎng)鏈非編碼RNA分子LINC01116。
　　第二部分:長(zhǎng)鏈非編碼RNA-LINC01116在人腦膠質(zhì)瘤臨床樣本中的表達(dá)情況及臨床意義
　　研究目的:擴(kuò)大臨床樣本驗(yàn)證LINC01116分子在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況，分析其與膠質(zhì)瘤患者的臨床病理指標(biāo)及生存預(yù)后是否存在關(guān)聯(lián)，并為其是否能作為膠質(zhì)瘤診斷和治療的靶點(diǎn)及評(píng)估膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的指標(biāo)提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究

11、方法:收集2004年1月至2015年12月間上海長(zhǎng)征醫(yī)院收治并手術(shù)的89例不同級(jí)別的腦膠質(zhì)瘤患者的臨床樣本與臨床資料及13例正常腦組織樣本，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)LINC01116分子在個(gè)樣本中的表達(dá)。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素分析、多因素分析、卡方檢驗(yàn)、相關(guān)性分析及生存分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析其與腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理指標(biāo)及生存預(yù)后的相關(guān)性。
　　結(jié)果:對(duì)比正常腦組織，qRT-PCR結(jié)果提示LINC01116在腦膠質(zhì)瘤樣本中呈顯著上調(diào)

12、表達(dá)，其在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)明顯高于低級(jí)別(P＜0.001)。通過(guò)將LINC01116在本組膠質(zhì)瘤臨床樣本中的表達(dá)與本組腦膠質(zhì)瘤患者的生存與預(yù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析我們發(fā)現(xiàn):LINC01116的表達(dá)與本組膠質(zhì)瘤患者的完全無(wú)進(jìn)展生存期（progression free survival，PFS）及總體生存期(overall survival，OS)均存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)系(P=0.043，P=0.008)，LINC01116表達(dá)量低的患者，其復(fù)發(fā)

13、和總體生存情況均較好。
　　結(jié)論:長(zhǎng)鏈非編碼RNA分子LINC01116在腦膠質(zhì)瘤組織中呈顯著高表達(dá)，且其與腦膠質(zhì)瘤患者的臨床病理級(jí)別及生存預(yù)后情況密切相關(guān)，具備成為腦膠質(zhì)瘤輔助性診斷分子標(biāo)志物和評(píng)估腦膠質(zhì)瘤患者生存預(yù)后指標(biāo)的潛能。
　　第三部分:長(zhǎng)鏈非編碼RNA-LINC01116在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的生物學(xué)功能與分子機(jī)制研究
　　研究目的:明確長(zhǎng)鏈非編碼RNA分子LINC01116在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的生物學(xué)

14、功能;初步探索LINC01116分子發(fā)揮生物學(xué)功能的分子機(jī)制及其下游可能的調(diào)控靶點(diǎn)，以期為膠質(zhì)瘤的分子診斷和臨床治療提供新的藥物作用靶點(diǎn)和思路，并提供相應(yīng)的理論和有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究方法:通過(guò)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251、U87MG、A172、U118MG中利用慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的干擾或過(guò)表達(dá)LINC01116分子的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，并在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期、CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力、transwell

15、小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移侵襲能力，及小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LINC01116分子對(duì)HUVEC細(xì)胞小管形成能力的影響，在U87MG細(xì)胞系中構(gòu)建干擾LINC01116分子的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系進(jìn)行裸鼠皮下荷瘤檢測(cè)LINC01116分子在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中對(duì)腫瘤形成的影響。通過(guò)在干擾LINC01116分子的U251穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中構(gòu)建表達(dá)譜基因芯片，結(jié)合qRT-PCR、Western bolt、雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)靶定LINC01116分子的下游靶基因及相關(guān)信號(hào)通

16、路。
　　結(jié)果:通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)干擾LINC01116的表達(dá)后，在體外細(xì)胞水平提示:膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)周期阻滯在G1期，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)減慢，增殖能力下降，同時(shí)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著下降。在體內(nèi)裸鼠皮下荷瘤提示:干擾LINC01116分子的表達(dá)后，裸鼠皮下成瘤能力顯著下降，對(duì)生成的腫瘤進(jìn)行血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelial growth factA，VEGFA)、CD31等分子的免疫組化發(fā)現(xiàn)，VEGFA、CD3

17、1的表達(dá)顯著下降，腫瘤內(nèi)部血管生成能力顯著下降。通過(guò)分析表達(dá)譜芯片結(jié)果并結(jié)合生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)VEGFA為L(zhǎng)INC01116分子的下游靶基因，且LINC01116分子與VEGFA分子的3'UTR區(qū)均存在miR-31-5p的結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)提示LINC01116與VEGFA分子的3'UTR區(qū)均可吸附miR-31-5p分子。Western bolt提示干擾LINC01116后VEGFA的蛋白表達(dá)下降。
　　結(jié)論:長(zhǎng)鏈