鋅指核酸酶與DNA相互作用的理論研究.pdf

1、由于金屬核酸酶小分子對DNA具有較好的切割性，越來越多的人們開始關(guān)注和設(shè)計此類核酸酶小分子。人們逐漸的發(fā)現(xiàn)雖然其對DNA有著很高的切割能力，但是它們的選擇特異性很差，在切割病態(tài)DNA的同時對正常的DNA也有很大的威脅。為此人們迫切需要一種選擇特異性好的核酸酶，此時鋅指蛋白的出現(xiàn)為這個問題的解決帶來了曙光。鋅指蛋白不僅能夠識別不同的DNA堿基序列，而且能夠穩(wěn)定的結(jié)合在DNA的大溝中。在鋅指蛋白的幫助下，金屬核酸酶小分子不僅通過對附近糖環(huán)中

2、氫的抽取實現(xiàn)了對DNA的特異性切割，而且還具有識別特定DNA堿基序列的功能。這引起了廣大研究者的興趣。
　　 在本論文中，主要做了以下三部分工作:
　　 一.采用分子對接方法研究了鋅指蛋白識別結(jié)合DNA的主要影響因素。通過改變DNA序列來考察鋅指蛋白對DNA結(jié)合強弱的影響。通過對兩者結(jié)合能的監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)當?shù)谝粋€鋅指結(jié)合位點的堿基序列由GCCC改變?yōu)榈诙€鋅指所識別的堿基序列CCGC時導致其結(jié)合能的降低，而當改變?yōu)榈谌齻€鋅指

3、所識別的CCCC堿基序列時，其結(jié)合能也隨之降低。但是對比兩個突變的堿基序列CCGC和CCCC時，發(fā)現(xiàn)后面三個堿基序列是緊相連著的C堿基時，其結(jié)合能要高于含G序列的。因此得出第一個鋅指在識別的過程中側(cè)重于識別其天然存在的GCCC序列，而后再識別CCGC和CCCC這兩個序列。
　　 二.鋅指核酸酶是通過連接域把鋅指蛋白和人工設(shè)計的金屬核酸酶小分子連接起來，鋅指核酸酶不僅能夠識別特定的DNA，還能促進DNA的解離。然而，由于目前在實驗

4、上很多鋅指核酸酶的晶體結(jié)構(gòu)很難得到，這樣就限制了鋅指核酸酶和DNA相互作用的理論研究。在本文中，通過HADDOCK軟件來預(yù)測鋅指蛋白核酸酶Sp1-Cu(BPA)和DNA的結(jié)合模式;然后進行了一個25ns的分子動力學模擬。模擬的結(jié)果表明Sp1的氨基酸殘基和DNA堿基通過氫鍵等作用力穩(wěn)定的作用在DNA大溝中，Cu(BPA)在模擬的過程中能穩(wěn)定的作用于DNA小溝內(nèi)，其方位對抽取鄰近糖環(huán)上的氫是有利的，使得金屬核酸酶小分子Cu(BPA)能夠在特

5、定區(qū)域促進DNA分子的斷裂。這些計算結(jié)果說明，DNA識別劑的鋅指蛋白的引入，很好地提升含銅核酸酶的DNA切割特異性。
　　 三.本部分主要研究了兩個有機反應(yīng)機理。第一個反應(yīng)是芳基疊氮化合物和二丁基三氟甲磺酸酯反應(yīng)生成N-烷基化苯胺的反應(yīng)。實驗上合成N-烷基化苯胺有很多方法，但是這些方法需要的實驗條件都是比較苛刻的，不是在高溫下就是使用有毒的或者腐蝕性的烷基化試劑。本文對Nagula教授提出的反應(yīng)機理用密度泛函的理論進行計算，來驗

6、證其的正確性。對所有的反應(yīng)物，過渡態(tài)，中間體和產(chǎn)物結(jié)構(gòu)都在DFT理論中B3LYP/6-31+G(d，p)的水平下進行優(yōu)化以確保所的結(jié)果的正確性，并對所有過渡態(tài)進行了IRC的計算，以確保過渡態(tài)是連接著預(yù)期的反應(yīng)物和產(chǎn)物。計算結(jié)果表明，疊氮化物在二烷基三氟甲磺酸酯的作用下，不僅能夠比較好的得到預(yù)期產(chǎn)物，而且反應(yīng)條件溫和，在室溫下反應(yīng)能發(fā)生。這些計算結(jié)果對設(shè)計新的反應(yīng)提供了理論上的支持和幫助。第二個反應(yīng)是多組分合成多取代的中氮茚。由于中氮茚衍

7、生物在具有生物活性的天然產(chǎn)物中關(guān)鍵的亞基結(jié)構(gòu)，有機熒光材料和藥物物質(zhì)等方面的廣泛應(yīng)用而引起了人們對其的極大重視。多組分反應(yīng)在有機化學，合成化學和藥物化學領(lǐng)域是一種強有力的和高效率的成鍵工具，三組分反應(yīng)已經(jīng)被證明是一種來合成中氮茚衍生物的比較直接的方法。ZhenjunMao研究組采用吡啶、苯甲酰甲基溴和乙基乙醛酸為反應(yīng)物，以乙腈為溶劑研究通過簡潔和高效的四組分串聯(lián)方法來合成多取代中氮茚衍生物，反應(yīng)涉及到吡啶鹽的葉立德形成，α，β-不飽和酮