基于表位定向哺乳動物細(xì)胞抗體庫篩選新型抗PD-1抗體.pdf

1、抗體藥物是現(xiàn)代生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的主力軍，其臨床應(yīng)用從最初的抗移植排斥逐步拓展至腫瘤、自身免疫疾病、抗感染、心腦血管疾病、眼科用藥以及生物安全防控等重大領(lǐng)域。治療性抗體的發(fā)展經(jīng)歷了多克隆抗血清、鼠源單克隆抗體、人源化抗體以及全人抗體四個階段。人源化以及全人抗體是抗體藥物發(fā)展的主流和趨勢。在人-人雜交瘤技術(shù)、轉(zhuǎn)基因小鼠、抗體庫技術(shù)以及 EB病毒轉(zhuǎn)化人 B淋巴細(xì)胞等全人抗體制備技術(shù)中，抗體庫技術(shù)是目前最為常用的技術(shù)之一。
　　噬菌體抗體庫技

2、術(shù)是目前抗體研發(fā)最廣泛使用的技術(shù)。阿達(dá)木單抗（修美樂）是該技術(shù)平臺下篩選獲批的首個全人源單抗藥物，并且連續(xù)幾年（2012-2015）蟬聯(lián)全球暢銷藥物排行榜之首。但是，與目前抗體藥物規(guī)模化生產(chǎn)常用的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系相比，噬菌體使用的原核表達(dá)系統(tǒng)缺乏精細(xì)的蛋白質(zhì)折疊和修飾過程，從中篩選獲得的抗體往往不能反映天然抗體的構(gòu)象和翻譯后修飾水平。因此，利用哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)展示天然構(gòu)象和翻譯后修飾的抗體具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值和前景。但是，受制于轉(zhuǎn)染效

3、率、培養(yǎng)體系等因素，哺乳動物細(xì)胞抗體庫往往庫容量較?。s106），限制了其廣泛應(yīng)用。計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)是近年來抗體優(yōu)化篩選的一個新興技術(shù)，利用計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)針對特異性抗原表位設(shè)計(jì)人工抗體庫，能在一定程度上提高抗體庫中功能性抗體以及高親和力抗體的比例。因此，利用計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)結(jié)合哺乳動物細(xì)胞展示系統(tǒng)有助于在有限的抗體庫容基礎(chǔ)上，優(yōu)化抗體庫質(zhì)量，提高抗體庫篩選效率。
　　腫瘤免疫治療經(jīng)歷了漫長的探索和重大的挫折之后逐漸顯現(xiàn)出良

4、好的治療效果并有望改變目前腫瘤的治療策略。針對CTLA-4、PD-1/PD-L1等“免疫卡控點(diǎn)分子”的單抗拮抗劑以及基于抗體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的新型 CART技術(shù)在腫瘤免疫治療領(lǐng)域突破性的療效奠定了抗體在該領(lǐng)域的重要地位。程序性死亡受體-1（PD-1）是一類重要的免疫負(fù)性調(diào)控分子（也稱“免疫卡控點(diǎn)分子”），主要在激活的T細(xì)胞和B細(xì)胞中表達(dá)，通過與NK等細(xì)胞表面的PD-L1以及PD-L2配體結(jié)合，激活負(fù)調(diào)控信號，抑制免疫細(xì)胞的過度活化。大量的研究顯

5、示，多種腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá) PD-L1分子，通過 PD-1/PD-L1信號通路形成機(jī)體免疫耐受，逃避機(jī)體的免疫反應(yīng)；特異性阻斷 PD-1/PD-L1信號通路，可以有效激活免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞。因此，PD-1/PD-L1成為腫瘤免疫治療的熱門靶標(biāo)。國外制藥巨頭針對 PD-1分子單抗藥物研發(fā)展開了激烈的競爭，其中BMS公司研發(fā)的Nivolumab抗體獲FDA上市批準(zhǔn)，應(yīng)用于轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤、鱗狀非小細(xì)胞肺癌、腎癌等多個腫瘤的臨床治療；除了

6、單藥使用外，Nivolumab與其他靶向藥物聯(lián)合使用的臨床試驗(yàn)正在開展，并取得良好的進(jìn)展。但是，目前國內(nèi)只有兩家企業(yè)生產(chǎn)的PD-1抗體獲得臨床批文。因此，篩選具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型PD-1抗體具有重要的理論和實(shí)際意義。
　　本論文構(gòu)建了哺乳動物細(xì)胞展示系統(tǒng)，并以PD-1為靶點(diǎn)，借助計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)獲得了靶向PD-1抗體庫，結(jié)合流式高通量篩選候選抗體；進(jìn)一步建立體內(nèi)外評價(jià)模型，合理評價(jià)候選抗體生物學(xué)活性。
　　具體研究結(jié)

7、果如下：
　　1、哺乳動物細(xì)胞展示系統(tǒng)的構(gòu)建及驗(yàn)證
　　為了實(shí)現(xiàn)抗體在哺乳動物細(xì)胞表面展示、單一細(xì)胞表達(dá)單一抗體基因等抗體庫篩選的基本原則，我們在FRT-Flp-In定點(diǎn)整合系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了抗體Fab結(jié)構(gòu)域膜表達(dá)載體PFRT/KIgG1FabHTM；同時(shí)構(gòu)建了全長抗體表達(dá)載體PRT/KIgG1，可實(shí)現(xiàn)與抗體庫中篩選獲得候選抗體進(jìn)行快速對接表達(dá)。流式細(xì)胞以及激光共聚焦等實(shí)驗(yàn)顯示，PFRT/KIgG1FabHTM載體能夠?qū)崿F(xiàn)

8、Fab抗體在哺乳動物細(xì)胞膜表面展示?？拱２├《究贵w、抗西尼羅河病毒抗體、抗PD-1抗體以及抗CD3抗體等多個抗體的瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果結(jié)果顯示，各抗體在全長抗體表達(dá)載體PRT/KIgG1上的瞬時(shí)表達(dá)量可達(dá)100μg/mL；利用該系統(tǒng)構(gòu)建了抗PD-1抗體、抗CD3抗體等多個抗體穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，規(guī)?；骷优囵B(yǎng)14天后抗體的表達(dá)量可達(dá)1.2g/L。提示，PRT/KIgG1載體是一套通用、高效的全長抗體表達(dá)載體。進(jìn)一步，我們利用紅、綠熒光蛋白驗(yàn)證FR

9、T-Flp-In體系是否能實(shí)現(xiàn)單一細(xì)胞表達(dá)單一抗體基因。研究結(jié)果顯示，F(xiàn)RT-Flp-In穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體系下，每個細(xì)胞均只表達(dá)一種熒光蛋白基因；表明FRT-Flp-In定點(diǎn)整合系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)單個細(xì)胞表達(dá)單一目的基因。借助構(gòu)建的哺乳動物表面展示系統(tǒng)，將抗PD-1陽性抗體 MIL75的Fab結(jié)構(gòu)域展示在 CHO表面，流式分析結(jié)果顯示， PD-1-FITC與細(xì)胞的結(jié)合呈劑量依賴性，提示該展示系統(tǒng)可以借助FACS實(shí)現(xiàn)高通量篩選。
　　2、靶向P

10、D-1抗體庫構(gòu)建及篩選
　　利用分子模擬與對接搭建PD-1與PD-L1復(fù)合物空間結(jié)構(gòu)，根據(jù)PD-L1與PD-1相互作用模式分析獲得 PD-L1參與識別 PD-1分子關(guān)鍵氨基酸殘基。進(jìn)一步選用Nivolumab抗體輕、重鏈可變區(qū)歸屬亞組(IgKV3-11*01、IgHV3-33*01)所對應(yīng)的通用序列為模板進(jìn)行合成抗體庫的設(shè)計(jì)，在抗體模板可及性表面積較大的殘基位點(diǎn)上引入一些與PD-L1關(guān)鍵殘基理化性質(zhì)相近的氨基酸突變，獲得與PD-L

11、1識別PD-1作用模式類似的靶向抗體庫。借助前期構(gòu)建的哺乳動物細(xì)胞展示平臺，構(gòu)建抗PD-1靶向抗體庫，轉(zhuǎn)化子計(jì)數(shù)和二代高通量測序結(jié)果顯示，抗體庫涵蓋了輕鏈及大部分重鏈理論序列（實(shí)測序列多樣性vs理論設(shè)計(jì)序列多樣性，輕鏈96/96;重鏈7321/8640）的多樣性。進(jìn)一步利用流式分選技術(shù)對構(gòu)建的細(xì)胞庫進(jìn)行3輪富集篩選，獲得陽性克隆并進(jìn)行測序獲得候選抗體序列。對候選抗體序列進(jìn)行序列比對分析，按照序列同源性以及主鏈碳原子均方根位移等參數(shù)將所測

12、120個抗體序列分為10組，并從中篩選13個代表性序列。將13個代表性的抗體序列進(jìn)行全長抗體表達(dá)，表達(dá)量結(jié)果提示13株抗體均具有較高表達(dá)水平（15.2μg/mL～74.5μg/mL）。其中FV63（59μg/mL）、FV78（74.5μg/mL）表達(dá)量明顯高于對照抗體MIL75（28.7μg/mL）。特異性結(jié)合活性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步篩選獲得5株親和力較好的抗體（1-4×10-10M）。借助生物信息學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)以及計(jì)算機(jī)輔助分子模擬技術(shù)對篩選獲

13、得的一系列抗體進(jìn)行抗體空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定能、識別PD-1分子空間表位等進(jìn)行理論評估，最終確定了兩株的功能活性較好的候選抗體FV74、FV78。初步結(jié)果顯示FV78表達(dá)量優(yōu)于上市抗體MIL75。
　　3、靶向PD-1新抗體FV78生物學(xué)活性評價(jià)
　　進(jìn)一步對靶向PD-1新抗體FV78開展體內(nèi)、外功能評價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)V78特異性識別人PD-1分子，并與CD28家族其它成員（CD28、CTLA4、BTLA、ICOS）不交叉；競爭E

14、LISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示FV78能夠有效阻斷PD-1與PDL1或PDL2之間相互作用，半數(shù)效應(yīng)濃度均為9.9μg/mL。體外PBMC活化模型以及DC-CD4+T混合淋巴培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校?FV78抗體能夠有效激活 T細(xì)胞釋放 IFN-γ。利用人外周血PBMC回輸免疫缺陷型小鼠 NPG，構(gòu)建移植物抗宿主疾病模型（GVHD），合理評價(jià)抗PD-1抗體的免疫激活活性。結(jié)果顯示，給予FV78抗體可以有效激活免疫系統(tǒng)，加重GVHD反應(yīng)，加速小鼠死亡(MS