金黃色葡萄球菌LukF和LukS基因的克隆和表達(dá).pdf

1、金黃色葡萄球菌是一種重要的致病菌，可以引起人和動(dòng)物的多種疾病，其主要致病物質(zhì)是毒素和酶，其中殺白細(xì)胞素可使白細(xì)胞失去吞噬功能，破壞中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。殺白細(xì)胞素是雙組分毒素，含F(xiàn)和S兩種成分，二者協(xié)同作用于白細(xì)胞膜上形成孔狀結(jié)構(gòu)，溶解白細(xì)胞。 本課題采用PCR的方法擴(kuò)增出金黃色葡萄球菌殺白細(xì)胞素F(lukF)基因和S(lukS)基因，分別與pMD18-T載體連接，并轉(zhuǎn)化到BL-21(DE3)大腸桿菌。經(jīng)PCR和BamHI、Sa

2、lI雙酶切鑒定后，獲得的陽性克隆質(zhì)粒命名為pMD-lukF和pMD-lukS。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步將兩個(gè)陽性克隆和pET32a(+)表達(dá)載體用BamHI/SalI雙酶切，回收目的片段，并連接轉(zhuǎn)化到BL-21(DE3)大腸桿菌，構(gòu)建出表達(dá)質(zhì)粒pET-lukF和pET-lukS。測(cè)序結(jié)果與GeneBank中公布的序列相比，lukF和lukS同源性均在99％以上，編碼的氨基酸序列的同源性均為100％。重組菌pET-lukF/DE3和pET-lukS/D

3、E3經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE，并用抗Histidine單抗進(jìn)行WesternBlot分析，結(jié)果pET-lukF/DE3表達(dá)出分子量約53kDa的蛋白質(zhì)，pET-lukF/DE3表達(dá)出分子量約54kDa的蛋白質(zhì)，二者分子量大小和DnaStar分析結(jié)果也相符，表明目的蛋白成功獲得表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，用MagneHisTM蛋白純化系統(tǒng)對(duì)表達(dá)的lukF和lukS蛋白進(jìn)行了純化，為下一步研究金黃色葡萄球菌殺白細(xì)胞素的作用機(jī)理和免疫保護(hù)作