抗Cry1Ac殺蟲晶體蛋白近等基因系小菜蛾中腸蛋白質(zhì)基因組學(xué)研究.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是目前世界上用途最廣、產(chǎn)量最大的微生物殺蟲劑，其編碼Bt殺蟲毒蛋白基因作為主要的殺蟲基因轉(zhuǎn)入到多種作物中，在害蟲防治中成效顯著。但與此同時(shí)，Bt制劑的大量使用和轉(zhuǎn)Bt作物的廣泛種植，使得Bt的抗性問題越來越嚴(yán)重。十字花科重要害蟲小菜蛾P(guān)lutellaxylostella(L.)是最早被發(fā)現(xiàn)且目前僅有的6種在田間對(duì)Bt產(chǎn)生抗性的害蟲之一。但到目前為止，Bt對(duì)小菜蛾的殺蟲作

2、用過程和小菜蛾對(duì)Bt的抗性機(jī)理，研究的仍不是完全清楚。
　　在本研究中，我們建立了對(duì)Cry1Ac有高于5000倍抗性的近等基因系小菜蛾種群，同時(shí)研究了其相關(guān)生物學(xué)特性。同時(shí)，我們首次利用shotgunHPLC-ESI-MS/MS技術(shù)對(duì)小菜蛾幼蟲中腸蛋白質(zhì)進(jìn)行了蛋白質(zhì)基因組分析。同時(shí)為了更好的揭示小菜蛾抗Cry1Ac的分子機(jī)理，我們利用iTRAQ和MRM兩種蛋白質(zhì)組分析技術(shù)，對(duì)兩個(gè)種群的中腸蛋白質(zhì)組進(jìn)行了定量分析，發(fā)現(xiàn)了大量差異表達(dá)

3、蛋白質(zhì)和可能的Bt受體。結(jié)果如下:
　　1.小菜蛾抗Cry1Ac近等基因系種群的構(gòu)建
　　我們利用弗羅里達(dá)Florida抗Cry1Ac小菜蛾DBM1Ac-R與紐約日內(nèi)瓦Geneva敏感種群DBM1Ac-S，建立了兩套近等基因系種群。經(jīng)ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)其近等性進(jìn)行評(píng)估發(fā)現(xiàn)，利用高世代回交法構(gòu)建的近等基因系抗性種群BC7F3(更名為NIL-R)，與輪回親本敏感種群DBM1Ac-S之間的遺傳相似度達(dá)到98.24％，具有較高的

4、相似度，且其對(duì)Cry1Ac毒蛋白的抗性倍數(shù)保持在5000倍以上，是理想的實(shí)驗(yàn)材料。
　　2.抗Cry1Ac近等基因系小菜蛾的抗性相關(guān)生物學(xué)研究
　　我們利用以上建立的抗Cry1Ac小菜蛾近等基因系種群NIL-R開展相關(guān)生物學(xué)研究。我們通過3次生命表對(duì)NIL-R種群的抗性適合度研究發(fā)現(xiàn):在卵的大小、壽命、幼蟲發(fā)育、成蟲壽命和產(chǎn)卵量上，抗性種群NIL-R與敏感種群DBM1Ac-S相比沒有顯著差別，說明NIL-R沒有出現(xiàn)發(fā)育的延遲

5、;利用兩種群的內(nèi)稟增長(zhǎng)率(R0)計(jì)算相對(duì)適合度，三次生命表結(jié)果分別為1.016、0.940和0.932，說明抗Cry1Ac小菜蛾近等基因系種群NIL-R沒有抗性適合度代價(jià)。根據(jù)交互抗性譜分析發(fā)現(xiàn):NIL-R對(duì)Cry1Ab毒蛋白和Cry1Ah蛋白具有一定的交互抗性，對(duì)Cry1Ca毒蛋白和Cry1Ie毒蛋白沒有交互抗性，由此我們可以推斷小菜蛾對(duì)Cry1A類毒蛋白可能具有共同的受體位點(diǎn)，而與Cry1Ca毒蛋白和Cry1Ie毒蛋白的受體位點(diǎn)不同

6、。利用單對(duì)雜交實(shí)驗(yàn)和劑量對(duì)數(shù)-期望死亡機(jī)率曲線兩種方法研究其遺傳方式發(fā)現(xiàn):抗性近等基因系種群NIL-R對(duì)Cry1Ac的抗性由一個(gè)常染色體、不完全隱形的基因位點(diǎn)決定。
　　3.利用shotgunESI-MS對(duì)小菜蛾幼蟲中腸進(jìn)行蛋白質(zhì)基因組研究
　　我們利用shotgunHPLC-ESI-MS/MS對(duì)小菜蛾幼蟲中腸蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)合其基因組數(shù)據(jù)，完成了首個(gè)小菜蛾中腸蛋白質(zhì)基因組分析。通過研究，一共得到了876，341張質(zhì)譜圖，

7、將這些質(zhì)譜圖與小菜蛾基因組的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)及全基因組6框翻譯的蛋白數(shù)據(jù)相比對(duì)，共鑒定出15，887條肽段。其中，12，004條肽段與已經(jīng)發(fā)表的小菜蛾基因組中的預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)信息相匹配，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了2113新肽段。利用這些發(fā)現(xiàn)的新肽段鑒定得到491個(gè)新基因，修正了202個(gè)小菜蛾基因組注釋基因。通過對(duì)小菜蛾中腸蛋白質(zhì)組的功能注釋分析我們發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)消化作用相關(guān)酶和基因在小菜蛾中腸蛋白質(zhì)中占據(jù)了重要地位，這可能是小菜蛾與其主要寄主十字花科作物的共進(jìn)化的又

8、一證據(jù)。同時(shí)我們從這些蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)鑒定到了大量與小菜蛾殺蟲劑抗性相關(guān)的蛋白質(zhì)，為小菜蛾適應(yīng)性及廣泛抗藥性等的分子機(jī)理、功能基因組研究供了必要的數(shù)據(jù)支持。
　　4.抗Cry1Ac近等基因系小菜蛾的比較蛋白質(zhì)組研究
　　我們利用iTRAQ技術(shù)，對(duì)NIL-R和DBM1Ac-S兩個(gè)種群的中腸BBMV進(jìn)行蛋白質(zhì)定量比較研究，共篩選出了128個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)。其中發(fā)現(xiàn)了氨肽酶和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)兩個(gè)已報(bào)道的Bt受體蛋白質(zhì)，在抗性種群中的表達(dá)

9、量顯著低于敏感種群。這可能說明這兩個(gè)蛋白質(zhì)也是Cry1Ac在小菜蛾中的受體。我們還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)葡糖基轉(zhuǎn)移酶的顯著升高。另外，我們還發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞色素P450解毒酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶兩個(gè)解毒酶在抗性種群中顯著升高的現(xiàn)象。隨后，我們利用MRM技術(shù)對(duì)找出的差異蛋白質(zhì)及已報(bào)道的Bt受體進(jìn)行質(zhì)譜定量檢測(cè)，比較以上蛋白質(zhì)在兩個(gè)種群的中腸樣品的表達(dá)量差異情況。MRM技術(shù)檢測(cè)的結(jié)果與iTRAQ結(jié)果基本一致。另外，我們還發(fā)現(xiàn)氨肽酶、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)、堿性磷酸酶、