廣州管圓線蟲五期幼蟲Acll基因的克隆、表達(dá)和鑒定.pdf

1、廣州管圓線蟲病，亦稱嗜酸性粒細(xì)胞增多性腦膜炎或腦膜腦炎(eosinophilicmeningitisormeningoencephalitis，EM)，系病原體廣州管圓線蟲(Angiostrongyluscantonensis)幼蟲侵害人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)而引起。廣州管圓線蟲病的確診主要靠從病人腦脊液中查到蟲體，但檢獲率很低，約為10％。通常該病的診斷需依靠臨床癥狀、流行病學(xué)資料和免疫診斷。由于蟲體抗原獲得比較困難，為了更方便獲得特異性診斷

2、抗原，本研究根據(jù)構(gòu)建的廣州管圓線蟲五期幼蟲cDNA文庫(kù)的免疫篩選結(jié)果，選擇文庫(kù)中表達(dá)的具有免疫反應(yīng)性并且同源性最高的Acll基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，PCR擴(kuò)增后克隆入pET28a(+)載體中，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)及免疫學(xué)鑒定。
　　 目的：
　　 1對(duì)前期用免疫探針篩選獲得的廣州管圓線蟲五期幼蟲特異性抗原Acll基因進(jìn)行T-A克隆及測(cè)序，利用生物信息學(xué)方法分析其結(jié)構(gòu)和功能，從而為下一步表達(dá)載體的構(gòu)建提供基因材料。
　　

3、 2通過(guò)構(gòu)建含廣州管圓線蟲五期幼蟲特異性抗原Acll基因的原核表達(dá)載體，獲得廣州管圓線蟲五期幼蟲特異性抗原Acll的融合蛋白，并對(duì)其進(jìn)行免疫學(xué)鑒定，從而為廣州管圓線蟲病的免疫診斷研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1廣州管圓線蟲五期幼蟲Acll基因的克隆及特性分析
　　 1.1T-A克隆后測(cè)序鑒定，BLAST同源性分析，并對(duì)其物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)。
　　 2廣州管圓線蟲五期幼蟲Acll基因原核表達(dá)系統(tǒng)的

4、構(gòu)建
　　 2.1EcoRI和XhoI雙酶切重組p30的T載體。
　　 2.2將Acll基因亞克隆至pET-28a(+)表達(dá)載體后轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)宿主菌中。
　　 2.3用誘導(dǎo)劑IPTG對(duì)重組蛋白Acll進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。
　　 3重組Acll融合蛋白的純化及鑒定
　　 3.1使用Ni離子親和層析柱純化重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Acll表達(dá)產(chǎn)生的重組蛋白，SDS-PAGE鑒定其純

5、度。
　　 3.2對(duì)純化蛋白進(jìn)行透析復(fù)性后，紫外分光光度法測(cè)定其濃度。
　　 3.3Westernblotting鑒定重組蛋白Acll的免疫學(xué)特性。
　　 3.4ELISA法檢測(cè)感染廣州管圓線蟲五期幼蟲的小鼠血清。
　　 結(jié)果：
　　 1PCR擴(kuò)增得到特異的廣州管圓線蟲五期幼蟲Acll基因，生物信息學(xué)分析得到廣州管圓線蟲五期幼蟲Acll基因序列與犬鉤蟲和秀麗隱桿線蟲一種推測(cè)的亞硫酸鹽氧化酶序列同源

6、性為78％。與原雞的亞硫酸鹽氧化酶的氨基酸序列同源性為98％。
　　 2成功構(gòu)建廣州管圓線蟲五期幼蟲Acll基因的原核表達(dá)系統(tǒng)，目的基因在克隆載體和表達(dá)載體中的測(cè)序結(jié)果完全相同。
　　 3表達(dá)產(chǎn)物主要存在于包涵體中，其相對(duì)分子質(zhì)量約為30kD，純化后的重組蛋白能被感染廣州管圓線蟲五期幼蟲的小鼠血清特異性識(shí)別，提示重組蛋白Acll具有良好的免疫反應(yīng)性。ELISA法檢測(cè)小樣本感染廣州管圓線蟲五期幼蟲的小鼠血清陽(yáng)性率為100％