廣州管圓線蟲五期幼蟲Acll基因的克隆、表達和鑒定.pdf

1、廣州管圓線蟲病，亦稱嗜酸性粒細胞增多性腦膜炎或腦膜腦炎(eosinophilicmeningitisormeningoencephalitis，EM)，系病原體廣州管圓線蟲(Angiostrongyluscantonensis)幼蟲侵害人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)而引起。廣州管圓線蟲病的確診主要靠從病人腦脊液中查到蟲體，但檢獲率很低，約為10％。通常該病的診斷需依靠臨床癥狀、流行病學資料和免疫診斷。由于蟲體抗原獲得比較困難，為了更方便獲得特異性診斷

2、抗原，本研究根據(jù)構建的廣州管圓線蟲五期幼蟲cDNA文庫的免疫篩選結果，選擇文庫中表達的具有免疫反應性并且同源性最高的Acll基因，并進行生物信息學分析，PCR擴增后克隆入pET28a(+)載體中，進行誘導表達及免疫學鑒定。
　　 目的：
　　 1對前期用免疫探針篩選獲得的廣州管圓線蟲五期幼蟲特異性抗原Acll基因進行T-A克隆及測序，利用生物信息學方法分析其結構和功能，從而為下一步表達載體的構建提供基因材料。
　　

3、 2通過構建含廣州管圓線蟲五期幼蟲特異性抗原Acll基因的原核表達載體，獲得廣州管圓線蟲五期幼蟲特異性抗原Acll的融合蛋白，并對其進行免疫學鑒定，從而為廣州管圓線蟲病的免疫診斷研究奠定基礎。
　　 方法：
　　 1廣州管圓線蟲五期幼蟲Acll基因的克隆及特性分析
　　 1.1T-A克隆后測序鑒定，BLAST同源性分析，并對其物理化學性質進行預測。
　　 2廣州管圓線蟲五期幼蟲Acll基因原核表達系統(tǒng)的

4、構建
　　 2.1EcoRI和XhoI雙酶切重組p30的T載體。
　　 2.2將Acll基因亞克隆至pET-28a(+)表達載體后轉入E.coliBL21(DE3)宿主菌中。
　　 2.3用誘導劑IPTG對重組蛋白Acll進行誘導表達。
　　 3重組Acll融合蛋白的純化及鑒定
　　 3.1使用Ni離子親和層析柱純化重組質粒pET-28a(+)-Acll表達產(chǎn)生的重組蛋白，SDS-PAGE鑒定其純

5、度。
　　 3.2對純化蛋白進行透析復性后，紫外分光光度法測定其濃度。
　　 3.3Westernblotting鑒定重組蛋白Acll的免疫學特性。
　　 3.4ELISA法檢測感染廣州管圓線蟲五期幼蟲的小鼠血清。
　　 結果：
　　 1PCR擴增得到特異的廣州管圓線蟲五期幼蟲Acll基因，生物信息學分析得到廣州管圓線蟲五期幼蟲Acll基因序列與犬鉤蟲和秀麗隱桿線蟲一種推測的亞硫酸鹽氧化酶序列同源

6、性為78％。與原雞的亞硫酸鹽氧化酶的氨基酸序列同源性為98％。
　　 2成功構建廣州管圓線蟲五期幼蟲Acll基因的原核表達系統(tǒng)，目的基因在克隆載體和表達載體中的測序結果完全相同。
　　 3表達產(chǎn)物主要存在于包涵體中，其相對分子質量約為30kD，純化后的重組蛋白能被感染廣州管圓線蟲五期幼蟲的小鼠血清特異性識別，提示重組蛋白Acll具有良好的免疫反應性。ELISA法檢測小樣本感染廣州管圓線蟲五期幼蟲的小鼠血清陽性率為100％