基于調控TGF-β-smad信號轉導龜鹿二仙膠促進成骨細胞合成Ⅰ型膠原蛋白改善骨質疏松的實驗研究.pdf

1、目前國內外針對骨質疏松癥開展了大規(guī)模、多方向的研究，其中中醫(yī)藥治療取得了很大進展，但其作用機制研究多側重骨礦鹽方面，對膠原蛋白合成的作用機制研究較少，尤其關于其作用分子機制及作用靶點探索的研究更為少見?；谠摫尘?，我們選擇經典中藥方劑龜鹿二仙膠，既往研究證實其具有益精填髓、補腎益氣，對骨質疏松模型膠原蛋白形成確有促進作用。其作用途徑研究尚未深入，通過何種途徑、何種通路及作用靶點如何？根據文獻研究，我們推測龜鹿二仙膠是通過調控TGF-β/

2、Smad信號轉導，刺激成骨細胞發(fā)揮其生物學作用，促進Ⅰ型膠原蛋白合成，從而起到治療骨質疏松的作用。
　　目的:
　　探討龜鹿二仙膠對成骨細胞合成Ⅰ型膠原蛋白及對GIOP斑馬魚模型魚鱗形態(tài)與組織結構的影響，探討龜鹿二仙膠對成骨細胞TGF-β/Smad信號通路的影響，分析龜鹿二仙膠對Ⅰ型膠原合成的促進作用及相關機制。
　　方法:
　　一、體外培養(yǎng)成骨細胞，應用中藥龜鹿二仙膠含藥血清培養(yǎng)成骨細胞，通過Western b

3、lot法檢測成骨細胞Ⅰ型膠原蛋白、TGF-β1、TGF-β2、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7等蛋白的合成;RT-PCR檢測成骨細胞Ⅰ型膠原蛋白、TGF-β1、TGF-β2、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7 mRNA的表達。探索龜鹿二仙膠對體外培養(yǎng)成骨細胞通過TGF-β/Smads信號通路合成Ⅰ型膠原蛋白的影響。
　　二、采用成年斑馬魚為模型動物，以糖皮質激素地塞米松為模型藥，以建立快速、高效的骨質疏松

4、新模型。龜鹿二仙膠對該模型進行干預，檢測斑馬魚魚鱗Ca（鈣）、P（磷）、ALP（堿性磷酸酶）、和Hyp（羥脯氨酸）含量，觀察斑馬魚膠原蛋白結構。RT-PCR檢測斑馬魚Ⅰ型膠原蛋白、TGF-β1、Smad3、Smad4、Smad7基因表達，Western blot法檢測斑馬魚Ⅰ型膠原蛋白、TGF-β1、Smad3、Smad4和Smad7蛋白的表達，分析龜鹿二仙膠通過TGF-β/Smad信號通路對骨質疏松斑馬魚模型Ⅰ型膠原合成的機制。

5、>　　結果:
　　1、成骨細胞Western blot法檢測結果顯示:給藥24小時，龜鹿二仙膠組高劑量組能使成骨細胞合成COL1A1、COL1A2增加，其余各組與正常組比較無顯著差異。第48小時，骨化三醇組、低、中、高濃度的龜鹿二仙膠組均能使成骨細COL1A1及COL1A2蛋白表達增加，其中，中、高劑量組COL1A1及COL1A2蛋白表達接近，均優(yōu)于骨化三醇組。給藥24小時和48小時，骨化三醇組TGF-β1、TGF-β2蛋白表達無

6、明顯增加;龜鹿二仙膠高劑量組對成骨細胞TGF-β1、TGF-β2蛋白表達有顯著的促進作用;給藥48小時，低、中、高劑量的龜鹿二仙膠組均能使成骨細胞TGF-β1、TGF-β2蛋白表達增加，中、高劑量的龜鹿二仙膠組差異無統計學意義。給藥24小時，龜鹿二仙膠高劑量組可以顯著提高Smad3蛋白表達的量;給藥48小時，低、中、高劑量龜鹿二仙膠組均能使成骨細胞Srnad3蛋白表達增加。給藥24小時及給藥48小時，各給藥組的Smad2、Smad4、S

7、mad7蛋白表達的量與正常組相比，差異無統計學意義。
　　2、成骨細胞RT-PCR法檢測結果顯示:骨化三醇組、低、中、高濃度的龜鹿二仙膠組均能使成骨細胞COL1A1及COL1A2 mRNA水平增加;中、高劑量龜鹿二仙膠組COL1A1、COL1A2mRNA水平增加較明顯;骨化三醇組對TGF-β1及TGF-β2 mRNA表達均無明顯影響;低、中、高劑量的龜鹿二仙膠組均能使成骨細胞TGF-β1、TGF-β2 mRNA水平增加;骨化三醇組

8、、低、中、高劑量的龜鹿二仙膠組均對成骨細胞Smad2、Smad4及Smad7的mRNA水平無明顯影響。骨化三醇組對Smad3的mRNA表達水平無明顯影響;低、中、高劑量的龜鹿二仙膠組均能升高成骨細胞的Smad3的mRNA水平。中、高劑量龜鹿二仙膠組Smad3mRNA水平增加程度接近。
　　3、成功建立激素誘導的骨質疏松(GIOP)斑馬魚模型，地塞米松誘導骨質疏松斑馬魚鱗片的變化，經Masson染色觀察，空白組斑馬魚Ⅰ型膠原組織結構

9、致密，交界清晰。地塞米松組自低劑量開始出現膠原結構松散，間隙擴大，界限模糊或推移改變，以高劑量組改變最為明顯。造模各組魚鱗Ca含量出現下降，其中中劑量地塞米松組魚鱗Ca含量出現明顯下降;高劑量地塞米松組魚鱗Ca含量下降。中、高劑量地塞米松組魚鱗P含量出現明顯下降;中、高劑量地塞米松組魚鱗ALP含量出現上升。
　　4、龜鹿二仙膠給藥后，龜鹿二仙膠各劑量組與骨化三醇組Ca含量明顯高于模型組。龜鹿二仙膠各劑量組與骨化三醇組P含量明顯高于

10、模型組;龜鹿二仙膠各劑量組與骨化三醇組ALP含量低于模型組，龜鹿二仙膠各劑量組與骨化三醇組能Hyp含量高于模型組。
　　5、Western-blot法檢測GIOP斑馬魚模型相關蛋白表達:骨化三醇組、低、中、高劑量的龜鹿二仙膠組均能使GIOP斑馬魚Ⅰ型膠原蛋白蛋白表達水平升高;其中中、高劑量龜鹿二仙膠組使斑馬魚Ⅰ型膠原蛋白蛋白表達水平顯著升高;骨化三醇組TGF-β1蛋白表達水平差異無統計學意義;低、中、高劑量龜鹿二仙膠組均能使GIO

11、P斑馬魚TGF-β1蛋白表達水平上升。骨化三醇組Smad3蛋白表達水平差異無統計學意義;低、中、高劑量的龜鹿二仙膠組均能使GIOP斑馬魚Smad3蛋白表達水平上升。各組之間斑馬魚Smad4、Smad7蛋白表達水平相互比較，差異無統計學意義。
　　6、RT-PCR法檢測GIOP斑馬魚相關蛋白mRNA表達:骨化三醇組、低、中、高劑量的龜鹿二仙膠組均能使GIOP斑馬魚Ⅰ型膠原蛋白mRNA水平升高;中、高劑量龜鹿二仙膠組中GIOP斑馬魚Ⅰ