Hsa-miR-125a-5p調(diào)控Rab25-PI3K-AKT通路在NSCLC-TKIs耐藥中的作用研究.pdf

1、目的：
　　耐藥是影響EGFR-TKIs臨床療效的主要因素之一。本課題擬在誘導(dǎo)厄洛替尼耐藥細(xì)胞基礎(chǔ)上，通過一系列實(shí)驗(yàn)探討miR-125a通過Rab25參與NSCLC EGFR-TKIs獲得性耐藥的相關(guān)機(jī)制。
　　方法：
　　1．miR-125a-5p、Rab25在肺腺癌中表達(dá)與TKIs耐藥的關(guān)系：通過PCR檢測(cè)3對(duì)親本株及對(duì)應(yīng)的耐厄洛替尼細(xì)胞株（A549/A549ER，PC9/PC9ER，HCC827/HCC827ER

2、）中miR-125a-5p、Rab25的表達(dá)，分析其相關(guān)性。
　　2．Hsa-miR-125a-5p與Rab25靶向調(diào)控關(guān)系驗(yàn)證：通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-125a-5p與Rab253’-UTR結(jié)合區(qū)域，構(gòu)建Rab253’-UTR-WT及對(duì)應(yīng)的突變載體Rab253’-UTR-MU、miR-125a-5p過表真核載體，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-125a-5p與Rab253'UTR區(qū)的結(jié)合情況。
　　3．miR-12

3、5a-5p及Rab25在TKIs獲得性耐藥的機(jī)制：分別構(gòu)建靶向干擾Rab25基因的慢病毒載體及過表達(dá)miR-125a的慢病毒載體，經(jīng)病毒包裝、濃縮后感染PC9ER，采用CCK-8法檢測(cè)耐藥性變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期變化，qRT-PCR和western-blot檢測(cè)Rab25、Akt、Caspase-3、PARP、EGFR、Bcl-2、BAX mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1．miR-125a-5p在T

4、KI耐藥株中呈低表達(dá)、Rab25在TKI耐藥株中呈高表達(dá)，且兩者均與TKI耐藥顯著性相關(guān)。
　　2．生物信息學(xué)顯示，miR-125a-5p與Rab25有相關(guān)作用的區(qū)域，位于Rab253’UTR區(qū)的120-126nt。成功構(gòu)建Rab25基因3’-UTR雙熒光素酶報(bào)告基因載體及其突變型載體,miR-125a過表達(dá)真核載體。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示組4（Rab253' UTR+miR-125a-5p）與組2（Rab253' UTR+m

5、iRNA-NC）比較熒光素酶活性顯著下降，P=0.0489，差異具有顯著性；組6（Rab253' UTR-MU+miR-125a-5p）與組4（Rab253'UTR+miR-125a-5p）比較熒光素酶活性顯著升高，P<0.0001，差異具有顯著性；其余各組熒光素酶活性表達(dá)均無(wú)顯著差異。上述結(jié)果證實(shí)Rab25基因miR-125a-5p直接作用的靶基因，且miR-125a-5p結(jié)合于Rab25基因的3’-UTR區(qū)域，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)Rab2

6、5基因有直接抑制作用。
　　3．成功構(gòu)建并鑒定干擾Rab25及過表達(dá)miR-125a-5p的慢病毒表達(dá)載體。CCK-8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)干擾Rab25及過表達(dá)miR-125a-5p能降低厄洛替尼對(duì)PC9ER細(xì)胞耐藥指數(shù)，發(fā)揮逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。流式分析發(fā)現(xiàn)干擾Rab25及過表達(dá)miR-125a-5p能增加厄洛替尼介導(dǎo)的PC9ER細(xì)胞凋亡及G0/G1期細(xì)胞阻滯。Real-Time RT-PCR及WB發(fā)現(xiàn)干擾Rab25及過表達(dá)miR-125a-5p

7、均能使PC9/ER細(xì)胞內(nèi)的Rab25、Bcl-2、PARP及Akt mRNA和蛋白的表達(dá)下調(diào)，尤其以AKT的磷酸化水平下調(diào)明顯，能夠增加BAX的mRNA及蛋白表達(dá)水平，增加C-PARP的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)論：
　　1. miR-125a-5p及Rab25在肺腺癌中均呈差異性表達(dá)，與TKI耐藥顯著性相關(guān)。
　　2. Rab25基因是has-miR-125a-5p直接作用的靶基因，且miR-125a-5p結(jié)合于Rab2