人乳頭瘤病毒16型E7蛋白單克隆抗體的研制.pdf

1、目的：人乳頭瘤病毒(HPV)是自然界中廣泛存在的一類DNA病毒，在人群中具有很高的感染率。HPV感染參與多種腫瘤的形成，其中包括各種消化道腫瘤。在HPV16感染的細(xì)胞中，HPV16 E7蛋白存在持續(xù)性表達(dá)，E7蛋白與腫瘤抑制蛋白R(shí)b蛋白結(jié)合，引起細(xì)胞內(nèi)多種蛋白的異常表達(dá)，是引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要原因之一，被認(rèn)定是HPV16相關(guān)腫瘤特異性抗原，也被廣泛地認(rèn)為是HPV16相關(guān)腫瘤免疫治療的理想靶點(diǎn)之一。目前報(bào)道HPV16感染相關(guān)的臨床診斷主

2、要依靠以PCR為主的分子生物學(xué)方法，該方法具有設(shè)備條件要求高、監(jiān)測結(jié)果假陽性率高等缺點(diǎn)。免疫組化方法則簡便、易行。研制和開發(fā)簡單有效的快速檢測HPV單克隆抗體診斷試劑盒對降低HPV感染性疾病的發(fā)病率和病死率均具有重要意義。為研究HPV16 E7蛋白在腫瘤早期預(yù)報(bào)中的作用及研制治療性疫苗，特制備HPV16 E7的單克隆抗體。
　　 方法：將構(gòu)建成的PGEx4T-1-HPV16 E7質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21細(xì)菌，在IPTG誘導(dǎo)下，穩(wěn)定表達(dá)G

3、ST-HPV16 E7融合蛋白。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，采用Western Blot進(jìn)行鑒定，HPV16 E7重組蛋白的相對分子質(zhì)量約為37kD。利用親和層析法從表達(dá)產(chǎn)物中純化出目的蛋白。以純化的GST-HPV16 E7蛋白為免疫原免疫Balb/c小鼠，運(yùn)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)將免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，采用ELISA雙篩，直至檢測所有孔均為E7陽性，而GST陰性為止，擴(kuò)大培養(yǎng)、建株、凍存并制備腹水、單克隆抗體。
　　

4、結(jié)果：
　　 1.將構(gòu)建成的PGEX4T-1-HPV16 E7的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21細(xì)菌，在IPTG誘導(dǎo)下，能穩(wěn)定表達(dá)GST-HPV16 E7融合蛋白，表達(dá)的融合蛋白的分子量約37kD。
　　 2.將細(xì)胞融合后，采用ELISA法雙篩，直至檢測所有孔均為E7陽性而GST陰性為止，擴(kuò)大培養(yǎng)、建株、凍存并制備腹水，腹水產(chǎn)量在3～10ml之間，其效價(jià)達(dá)10-6。
　　 3.成功制備出HPV16 E7單克隆抗體，可在多