香菇轉(zhuǎn)錄本功能域蛋白LatcripiN-9的表達、純化及生物學(xué)活性研究.pdf

1、香菇C91-3菌株是本課題組經(jīng)過多年篩選獲得的一株具有較強應(yīng)用價值的真菌。香菇C91-3菌株菌絲體發(fā)酵液具有較好的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用已經(jīng)被本課題組所證實。在此基礎(chǔ)上，通過生物信息學(xué)分析，初步篩選出一些與細(xì)胞凋亡相關(guān)的目的基因，并對其進行命名。再通過cDNA末端的快速擴增(Rapid Amplification ofcDNA ends，RACE)方法和生物信息學(xué)比對，獲得基因全長及相應(yīng)的氨基酸序列。本實驗的研究對象是香菇C91-3菌株

2、Latcripin-9基因。
　　目的:利用生物信息學(xué)方法尋找并確定Latcripin-9的基因序列、功能域片段及相應(yīng)的氨基酸序列。對Latcripin-9蛋白的二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)進行分析預(yù)測，全面獲取Latcripin-9基因的詳細(xì)信息。構(gòu)建原核表達載體pET32a(+)-Latcripin-9，IPTG誘導(dǎo)使Latcripin-9蛋白在大腸桿菌Rosetta-gami(DE3)中表達，并對誘導(dǎo)表達產(chǎn)物進行鑒定。通過生物信息學(xué)軟

3、件分析，預(yù)測出Latcripin-9蛋白的生物學(xué)活性及相應(yīng)功能。采用不同方法檢測Latcripin-9蛋白的體外抗氧化活性，并進一步將香菇C91-3菌株重組蛋白Latcripin-9作用于不同的腫瘤細(xì)胞，對Latcripin-9蛋白在體外抗腫瘤方面的效果進行初步研究，本實驗將為深入研究Latcripin-9蛋白的生物學(xué)功能及發(fā)掘其應(yīng)用潛力奠定良好的物質(zhì)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　方法:①從香菇C91-3菌株中提取其總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄獲

4、得cDNA文庫，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄的結(jié)果，利用高通量測序獲得轉(zhuǎn)錄組mRNA，通過生物信息學(xué)比對，獲得目的序列。利用3'-Full RACE、5'-Full RACE方法獲得目的基因Latcripin-9的基因全長。經(jīng)NCBI、Pfam等數(shù)據(jù)庫在線比對分析得到Latcripin-9功能域序列，進一步通過生物信息學(xué)技術(shù)分析獲得Latcripin-9功能域序列的氨基酸組成、預(yù)測其理化性質(zhì)及生物學(xué)活性。②將Latcripin-9的功能域序列克隆到原核表

5、達載體pET32a(+)中，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET32a(+)-Latcripin-9，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli Rosetta-gami(DE3)中，對其進行誘導(dǎo)表達，利用SDS-PAGE及WesternBlotting方法鑒定表達產(chǎn)物。采用鎳柱親和層析的方法對重組Latcripin-9蛋白進行分離純化，并通過尿素梯度透析復(fù)性純化后的目的蛋白，BCA法測定復(fù)性后的蛋白濃度。③圓二色光譜法測定復(fù)性后的Latcripin-9蛋

6、白的二級結(jié)構(gòu)。④Latcripin-9蛋白的抗氧化活性測定:分別采用DPPH(2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)法、FRAP(Ferric Reducing Antioxidant Power)法、ABTS(2,2-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate))法等3種方法測定Latcripin-9蛋白的抗氧化活性;⑤Latcripin-9蛋白的抗腫瘤活性研究:將L

7、atcripin-9蛋白作用于人肺癌細(xì)胞A549，采用四氮唑藍比色分析法(Methyl Thiazoly LtetraZolium，MTT)法測定Latcripin-9蛋白對腫瘤細(xì)胞A549生長的抑制效果;同時用MTT法檢測Latcripin-9蛋白對雞胚成纖維細(xì)胞、Vero細(xì)胞生長的影響;采用透射電鏡法觀察Latcripin-9蛋白作于人喉癌Hep-2細(xì)胞及人肺癌A549細(xì)胞后，細(xì)胞相應(yīng)的形態(tài)學(xué)變化;用采用流式細(xì)胞術(shù)檢測Latcrip

8、in-9蛋白作用于A549細(xì)胞后，細(xì)胞的凋亡情況。
　　結(jié)果:①采用RACE方法獲得Latcripin-9基因全長，通過PCR擴增獲得功能域序列。對Latcripin-9功能域序列分析，發(fā)現(xiàn)其為染料脫色過氧化物酶結(jié)構(gòu)(DyP_Perox)。②利用EcoRI和Xho I兩種限制性內(nèi)切酶，通過雙酶切的方法確定在原核表達載體pET32a(+)中成功插入Latcripin-9功能域基因序列。利用SDS-PAGE及Western Blott

9、ing方法驗證Latcripin-9蛋白表達成功。所得蛋白經(jīng)鎳柱親和層析法純化獲得單一目的蛋白。采用BCA方法測定目的蛋白的濃度，得到標(biāo)準(zhǔn)直線方程y=0.0462x+0.0108，R2=0.9986。通過方程計算獲得蛋白濃度:1.671mg/mL。③3種國內(nèi)外常用的體外抗氧化活性能力檢測法(DPPH法、FRAP法、ABTS法)結(jié)果顯示，目的蛋白Latcripin-9具有明顯的抗氧化能力，且抗氧化能力隨著濃度的增加而增強，但與維生素C(V

10、C)相比，弱于VC。④MTT結(jié)果表明，Latcripin-9蛋白對雞胚成纖維細(xì)胞及Vero細(xì)胞無毒性作用，對人肺癌細(xì)胞A549的生長具有明顯的抑制作用，且具有一定的時間和濃度依賴性，當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?00μg/mL，作用12h時，抑制率達到最大(約為30％)，與對照組比有顯著差異。電鏡結(jié)果可知，Latcripin-9蛋白能夠引起人肺癌細(xì)胞A549出現(xiàn)自噬，誘導(dǎo)人喉癌細(xì)胞Hep-2凋亡。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明目的蛋白對人肺癌細(xì)胞A549有殺傷

11、作用，能夠引起細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。
　　結(jié)論:①通過對香菇C91-3菌株的轉(zhuǎn)錄組序列進行相關(guān)生物信息學(xué)分析，成功篩選出具有過氧化物酶活性的Latcripin-9基因，并通過RACE方法得到相應(yīng)的基因序列全長。②采用基因重組技術(shù)成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a(+)-Latcripin-9，采用熱轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化該質(zhì)粒到大腸桿菌表達宿主E.coli Rosetta-gami(DE3)中，使重組Latcripin-9蛋白得到了成功表達。親和層析法

12、成功對Latcripin-9蛋白進行純化，尿素梯度透析法成功復(fù)性Latcripin-9蛋白。③體外抗氧化活性研究表明，Latcripin-9蛋白具有抗氧化活性，為進一步研究其在抗氧化方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。④MTT法初步證明Latcripin-9蛋白對正常雞胚成纖維細(xì)胞、Vero細(xì)胞無毒性作用，對人肺癌細(xì)胞A549的生長具有明顯的抑制作用，初步研究表明Latcripin-9蛋白對Hep-2細(xì)胞、A549細(xì)胞生長均具有一定的抑制作用，為進一步