雞球蟲四種重組蛋白體外雞外周血單個核細胞功能的影響.pdf

1、雞球蟲病(Coccidiosis)是近年來限制養(yǎng)雞業(yè)集約化發(fā)展的一類由艾美爾屬(Eimeria)的9種球蟲引起的寄生蟲病。該病主要以腸道病變?yōu)橹鳎梢痣u消瘦、腹瀉、拉血便，嚴重的可引起動物死亡，給養(yǎng)雞業(yè)帶來了巨大的經濟損失。目前，各種抗球蟲藥物的使用依然是防治該病的主要措施，但是蟲株對于藥物的耐藥性，以及對于禽類食品安全問題的的重視，人們開始尋找能夠有效防治球蟲病的方法。疫苗免疫不存在藥物殘留問題，而且安全高效。近幾年，雞球蟲病的各種

2、疫苗研究已逐漸引起研究人員的重視，并取得了一定的成果。
　　正確的認識和掌握雞球蟲的生物學特性和抗雞球蟲的免疫保護機制，成為尋找更好的免疫保護抗原，研制免疫保護力強的雞球蟲病疫苗的重要前提，也是防治球蟲病的的重要理論依據。
　　本實驗室已經從幾種雞球蟲中獲得多種抗原基因，，并成功構建了重組質粒。本試驗在此基礎上選取雞堆型艾美爾球蟲抗原3-1E、巨型艾美爾球蟲抗原EM6、EM8和堆型艾美爾球蟲抗原MIF進行了了重組表達，進而研

3、究這四種重組蛋白體外對雞外周血單個核細胞多種功能的影響。
　　1.雞球蟲四種蛋白的表達及體外與雞外周血單個核細胞的結合試驗
　　根據實驗室構建的重組質粒，表達純化3-1E、EM6、EM8和MIF四種重組蛋白，無菌采集雞抗凝血，分離外周血單個核細胞，將重組蛋白以5μg/mL的濃度加入細胞懸液中，放置細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)2h后收集細胞，應用免疫熒光抗體技術，激光共聚焦顯微鏡下觀察檢測發(fā)現(xiàn)重組蛋白EM8和MIF能夠與雞外周血單個核細胞

4、結合，其余兩種蛋白沒有結合。
　　2.雞四種重組蛋白對雞外周血單個核細胞細胞因子表達的影響
　　根據GenBank中雞IL-4、IL-17、IFN-γ和TGF-β的序列登錄號設計合成符合熒光定量試驗的PCR引物探針。以GAPDH為內參，用3-1E、EM6、EM8和MIF四種重組蛋白按濃度梯度分別刺激外周血單個核細胞后收集細胞提取RNA后合成cDNA為模板，進行熒光定量檢測試驗，分析細胞在不同濃度重組蛋白刺激后的細胞因子的 m

5、RNA轉錄水平，結果發(fā)現(xiàn)，重組蛋白刺激單核細胞后，細胞因子IL4、IL/17D、IFN-γ和TGF-β4均有不同程度的變化，其中四組實驗組的INF-γ的變化均比較顯著(p＜0.05);另外，重組蛋白EM6、EM8可比較顯著的引起四種細胞因子變化(p＜0.05)。
　　3.雞球蟲四種重組蛋白對鳩外周血單個核細胞增殖的影響
　　為了檢測3-1E、EM6、EM8和MIF對雞外周血單個核細胞的增殖作用，將不同濃度的重組蛋白分別與細胞

6、共培養(yǎng)24小時后，利用CCK-8法檢測增殖效果。結果發(fā)現(xiàn)，四種重組蛋白對細胞具有一定的刺激其增殖的作用。且在一定濃度下增殖情況比對照組差異顯著(P＜0.05)，其中重組蛋白EM8和MIF在幾個濃度梯度下的增殖情況均極顯著高于對照組(P＜0.01)。
　　4.雞球蟲四種重組蛋白對雞巨噬細胞吞噬功能和分泌NO的影響
　　為了檢測重組蛋白3-1E、EM6、EM8和MIF對雞的巨噬細胞功能的影響，本試驗檢測了巨噬細胞對中性紅的吞噬能

7、力，并測定了不同濃度重組蛋白作用巨噬細胞后細胞培養(yǎng)液中的NO濃度。試驗結果表明，重組蛋白EM8和MIF均能夠使巨噬細胞的吞噬功能和NO分泌功能增強，而其余重組蛋白產生效果并不明顯
　　5.重組蛋白EM8和MIF對雞外周血T細胞和單核細胞的不同調節(jié)作用
　　外周血單個核細胞有兩個主要的亞群單核細胞和T細胞，它們在固有免疫和獲得性免疫中發(fā)揮著重要作用。不同的蛋白分子對不同類型的細胞具有多種不同的調節(jié)作用。在本試驗中，我們研究了重