哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白在流感病毒感染中的作用.pdf

1、目的：研究哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of Rapamycin，mTOR)在流感病毒感染過程中對(duì)宿主細(xì)胞蛋白及病毒NP蛋白表達(dá)的影響。
　　 方法：在人肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞，接種流感病毒毒株P(guān)R8株(Influenza A virusPuertoRico/8/34-H1N1)，在感染后5h，采用Western-blot檢測(cè)Akt、4E-BP1等蛋白及磷酸化水平；采用常規(guī)分子克隆技術(shù)構(gòu)建流感病毒NS

2、1蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-NS1;在A549細(xì)胞系，檢測(cè)NS1蛋白表達(dá)對(duì)熒光素酶報(bào)告基因（在pcDNA3.1-NS1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24h后轉(zhuǎn)染pGL3質(zhì)粒）表達(dá)活性的影響；使用PI3K抑制劑LY294002及兩種mTOR抑制劑（Rapamycin和Torin1）阻斷相應(yīng)分子的功能，以確定mTOR影響流感病毒感染過程所涉及的上下游分子。
　　 結(jié)果：流感病毒感染后5h，Akt和4E-BP1的磷酸化水平顯著提高，提示mTOR可能

3、在流感病毒感染中起一定的作用。PI3K的抑制劑LY294002可恢復(fù)Akt和4E-BP1的低磷酸化狀態(tài)。mTORC1的抑制劑Rapamycin，mTORC1/2的抑制劑Torin1也可下調(diào)4E-BP1的磷酸化水平，其中Torin1對(duì)4E-BP1磷酸化水平的抑制效果顯著強(qiáng)于Rapamycin，接近LY294002，提示mTORC2復(fù)合物參與了流感病毒誘導(dǎo)的mTOR活化過程。質(zhì)粒表達(dá)NS1蛋白可增加細(xì)胞Akt和4E-BP1的磷酸化。pGL3

4、質(zhì)粒與pcDNA3.1-NS1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)顯示，pcDNA3.1-NS1組螢火蟲熒光素酶表達(dá)活性明顯高于pcDNA3.1對(duì)照組，而LY294002、Rapamycin和Torin1則不同程度的抑制了熒光素酶的表達(dá)，其效應(yīng)大小與這三種抑制劑對(duì)4E-BP1的磷酸化下調(diào)效應(yīng)大小相一致。在流感病毒感染后5h，在本研究所使用的抑制劑濃度下，Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示，LY294002、Rapamycin和Torin1三種抑制劑對(duì)流感病