NAC對(duì)銅腙短期暴露導(dǎo)致的小鼠工作記憶和神經(jīng)生物學(xué)變化的影響.pdf

1、背景和目的：
　　精神分裂癥是一種發(fā)病機(jī)制尚不明確的嚴(yán)重的精神障礙。精神分裂癥病人的影像學(xué)及尸檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)，部分病人存在腦白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞，提示精神分裂癥可能與腦白質(zhì)損傷有關(guān)。雙環(huán)己酮草酰二腙（ Cuprizone， CPZ）是一種銅離子螯合劑，可以引起少突膠質(zhì)細(xì)胞（Oligodendrocytes，OLs）減少及髓鞘脫失，也可以導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)類似精神分裂癥病人的行為學(xué)改變。因此，C P Z暴露小鼠被用作精神分裂癥的新型動(dòng)物模型，探討白

2、質(zhì)損害導(dǎo)致精神分裂癥樣行為的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑橛^察抗氧化劑 N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）對(duì)CPZ暴露導(dǎo)致的動(dòng)物行為和神經(jīng)生物學(xué)改變的作用，并探討其作用機(jī)制。NAC已經(jīng)用于精神分裂癥的輔助治療，我們假設(shè)該藥可能通過抗氧化和抗炎機(jī)制減輕腦白質(zhì)損傷，改善動(dòng)物行為。
　　材料和方法：
　　雄性6周齡C57BL/6小鼠60只，隨機(jī)分為5組，每組12只，分別為：1）正常對(duì)照組，該組動(dòng)物腹腔注射生

3、理鹽水，每天一次，持續(xù)兩周，動(dòng)物食用標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用自來水，2） NS+CPZ組，該組動(dòng)物腹腔注射生理鹽水，每天一次，持續(xù)兩周，期間第5-14天食用含銅腙（0.2％，w/w）的飼料，3）NAC（L）+CPZ組，該組動(dòng)物腹腔注射NAC（100 mg/kg/day），每天一次，持續(xù)兩周，期間第5-14天食用含銅腙（0.2%，w/w）的飼料，4）NAC(M)+CPZ組，該組動(dòng)物腹腔注射NAC（200 mg/kg/day），每天一次，持續(xù)兩周，期

4、間第5-14天食用含銅腙（0.2%，w/w）的飼料，5）NAC(H)+CPZ組，該組動(dòng)物腹腔注射NAC（400 mg/kg/day），每天一次，持續(xù)兩周，期間第5-14天食用含銅腙（0.2%，w/w）的飼料。最后一次腹腔注射后24小時(shí)，進(jìn)行動(dòng)物行為學(xué)測(cè)試，順序?yàn)闀鐖?chǎng)實(shí)驗(yàn)-社交行為實(shí)驗(yàn)-Y-迷宮實(shí)驗(yàn)。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組半數(shù)動(dòng)物(6只)在深麻醉狀態(tài)下（戊巴比妥鈉，80 mg/kg,腹腔注射）取肝臟組織，并分離出大腦皮質(zhì)（CTX），尾殼核

5、（CPU）和海馬（Hip），檢測(cè)T-SOD、GSH-Px、H2O2、MDA含量，做酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)促炎細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的濃度。余下每組6只小鼠在深麻醉狀態(tài)下灌注固定取腦，用免疫組織化學(xué)及免疫熒光方法檢測(cè)小鼠腦組織少突膠質(zhì)細(xì)胞（GST-Pi陽性細(xì)胞）、髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）及小膠質(zhì)細(xì)胞(Iba-1

6、陽性細(xì)胞)的變化。采用Excel2007和SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Means±SEM）表示。采用單因素方差分析。組間兩兩比較之前進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊則采用Tukey HSD檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett T3檢驗(yàn)。P＜0.05定義為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01定義為差別具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1. CPZ短期暴露對(duì)小鼠行為學(xué)的影響以及N-乙酰半胱氨酸的干預(yù)作用
　　

7、1.1.曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：5組小鼠的總路程、中央路程、中央路程/總路程之比，以及在中央?yún)^(qū)活動(dòng)的時(shí)間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　1.2.社交行為實(shí)驗(yàn)：5組小鼠均能區(qū)分空籠及籠內(nèi)存在不熟悉同類的情況，因?yàn)樗鼈冊(cè)诨\子里有目標(biāo)小鼠的情況下比空籠狀態(tài)下在籠周活動(dòng)更長(zhǎng)的時(shí)間。但是各組之間無差別。
　　1.3. Y-迷宮實(shí)驗(yàn)：5組小鼠的入臂次數(shù)差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。NS+CPZ組小鼠的自發(fā)交替率低于Control組（P＜0

8、.05），但是，經(jīng)NAC處理的CPZ暴露小鼠未見這種異常行為，它們與正常組比較無差別。
　　2. CPZ短期暴露對(duì)小鼠組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響以及N-乙酰半胱氨酸的干預(yù)作用
　　2.1. T-SOD活力檢測(cè)：在CTX和肝臟組織，NS+CPZ組與Control組比較，T-SOD活力降低（P＜0.05），而經(jīng)NAC處理的CPZ暴露組T-SOD的活力與Control組沒有差別。在CPU和Hip腦區(qū)，5組T-SOD活力差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)

9、意義。
　　2.2. GSH-PX活力檢測(cè)：在CTX、CPU、Hip3個(gè)腦區(qū)，5組GSH-PX活力檢測(cè)結(jié)果均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　2.3. H2O2檢測(cè)：在CTX、CPU、Hip腦區(qū)和肝臟，5組H2O2檢測(cè)結(jié)果均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　2.4. MDA檢測(cè)：在CTX、Hip、和肝組織，NS+CPZ組MDA含量高于對(duì)照組，但是NAC處理組與對(duì)照組無差別。在CPU腦區(qū)，5組MDA檢查結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)

10、差異。
　　3. CPZ短期暴露對(duì)小鼠腦內(nèi)IL-1β和TNF-α的影響以及N-乙酰半胱氨酸的干預(yù)作用
　　3.1. IL-1β：在CTX，NS+CPZ組高于對(duì)照組（P＜0.05），但是在NAC（H）未見此種變化。在CPU和Hip，NS+CPZ組高于對(duì)照組（P＜0.05、P＜0.01），而經(jīng)低、中、高劑量的NAC處理的CPZ暴露組均與對(duì)照組IL-1β沒差別，較NS+CPZ組降低。
　　3.2. TNF-α：在CPU和Hi

11、p， NS+CPZ組TNF-α的含量高于對(duì)照組（P＜0.05、P＜0.01），而低、中、高劑量的NAC均能緩解CPZ引起的TNF-α增高。在CTX，5組TNF-α的含量差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　4. CPZ短期暴露對(duì)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的影響以及N-乙酰半胱氨酸的干預(yù)作用
　　利用能特異性地識(shí)別小膠質(zhì)細(xì)胞的抗體（Iba-1），我們實(shí)施了免疫熒光染色識(shí)別并利用Image-Pro Plus6.0(IPP6.0)軟件計(jì)數(shù)Iba-1陽性細(xì)

12、胞。在CC、CPU、CTX、和海馬CA1、CA3、DG區(qū)，NS+CPZ組比對(duì)照組有更多的Iba-1（+）細(xì)胞（p＜0.01），而且它也比NAC（L）和NAC（H）組的該指標(biāo)顯著增多（p＜0.01）。
　　5. CPZ短期暴露對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞及髓鞘堿性蛋白的影響以及N-乙酰半胱氨酸的干預(yù)作用
　　利用能特異性地識(shí)別成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞（GST-Pi抗體）和髓鞘（MBP抗體）的抗體，我們實(shí)施了免疫組織化學(xué)染色并利用Image-Pro

13、Plus6.0(IPP6.0)軟件進(jìn)行定量分析。在CC、CPU、CTX和海馬CA1、CA3、DG區(qū)，NS+CPZ組比對(duì)照組有更少的GST-Pi（+）陽性細(xì)胞數(shù)（P＜0.01），而且它也較NAC（L）和NAC（H）組的該指標(biāo)顯著減少（P＜0.01）。以上腦區(qū)的MBP免疫組織化學(xué)染色分析結(jié)果5組之間差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1. CPZ暴露10天對(duì)小鼠的空間工作記憶有損害，NAC處理對(duì)CPZ引起的空間工作記憶損害有改

14、善作用。
　　2. CPZ暴露10天引起小鼠CTX及肝臟組織T-SOD降低，NAC處理緩解了CPZ引起的T-SOD降低。CPZ暴露導(dǎo)致小鼠大腦皮層、海馬及肝臟組織MDA升高，NAC處理阻斷了CPZ引起的MDA增加。
　　3. CPZ暴露10天導(dǎo)致小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增多，腦內(nèi)炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α含量增多，NAC處理減輕了這些神經(jīng)炎癥反應(yīng)指標(biāo)。
　　4. CPZ暴露10天導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目減少，NAC處