馬鈴薯microRNA的鑒定及分析.pdf

1、MieroRNAs(miRNAs)是廣泛存在于真核生物細(xì)胞的一類內(nèi)源性小分子單鏈非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)，大小為21 nt左右。研究表明，這些miRNA作為一種真核生物體內(nèi)的重要的調(diào)節(jié)因子，在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，并影響著生物體生命活動(dòng)的各個(gè)方面。雖然目前通過(guò)實(shí)驗(yàn)和計(jì)算機(jī)的方法在植物和動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了眾多miRNA分子，但是在各個(gè)物種中所鑒定的miRNA的數(shù)量遠(yuǎn)不及理論上的飽和值，所以對(duì)miRNA的分

2、離鑒定依然是miRNA研究的一個(gè)熱點(diǎn)。 馬鈴薯(S.tuberosum L．)屬茄屬多年生草本植物，它作為世界上廣為栽培且種植面積位居第四的重要糧食作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人民生活中均占有極其重要的地位，然而馬鈴薯極易受植物病毒的危害而造成種質(zhì)退化和減產(chǎn)。近期的研究表明miRNA與植物每個(gè)階段的生長(zhǎng)發(fā)育息息相關(guān)，且參與植物的防御和應(yīng)答外界環(huán)境壓力脅迫，所以對(duì)馬鈴薯miRN_A的研究有著非常重要的現(xiàn)實(shí)和理論意義。而對(duì)馬鈴薯miRNA研究

3、的第一步就是找出馬鈴薯中盡可能多的miRNA，以及它們作用的靶標(biāo)。 本研究利用計(jì)算機(jī)RNA組學(xué)方法在馬鈴薯EST數(shù)據(jù)庫(kù)、GSS數(shù)據(jù)庫(kù)和nr數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋保守的馬鈴薯miRNA分子，然后采用RT-PCR手段對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，并觀察它們?cè)诓煌M織中的表達(dá)情況。利用在線分析軟件分析馬鈴薯miRNA的靶序列，并對(duì)靶序列的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果小結(jié)如下： 1．在數(shù)據(jù)庫(kù)中共搜尋出48條保守的馬鈴薯miRNA候選分子，其中30條miR

4、NA．來(lái)源于EST數(shù)據(jù)庫(kù)，11條miRNA來(lái)自于GSS數(shù)據(jù)庫(kù)，7條miRNA鑒定于nr數(shù)據(jù)庫(kù)。這些miRNA候選分子與已知擬南芥或水稻的miRNA有著高度同源性。 2．在研究馬鈴薯miRNA分子中，發(fā)現(xiàn)一些僅存在于雙子葉植物中的miRNA分子，如miR403、miR869和miR870。通過(guò)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，僅成熟的植物miRNA分子表現(xiàn)較為保守，而其前體變化較大。 3．使用在線預(yù)測(cè)植物miRNA的軟件——microHARV

5、ESTER，在44種不同植物物種中預(yù)測(cè)出136條保守的miRNA候選分子。通過(guò)計(jì)算分析發(fā)現(xiàn)，大部分候選分子的MFEI。值大于0.7，可信度較高。 4．通過(guò)分析這48條馬鈴薯miRNA，最終篩選出186個(gè)潛在靶分子，其中～20％的靶分子為一些在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子；～30％的靶分子參與調(diào)控馬鈴薯體內(nèi)的代謝過(guò)程、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、對(duì)外界環(huán)境脅迫的應(yīng)答以及調(diào)控自身合成；～24％的靶分子我們未預(yù)測(cè)出其功能。 5．針對(duì)不

6、同的植物RNA提取具有不同要求的情況，以富含淀粉、多糖物質(zhì)的馬鈴薯根為材料，在現(xiàn)有植物RNA提取方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良。RNA電泳分析，純度鑒定及RT-PCR結(jié)果顯示，該方法提取的RNA質(zhì)量好，純度高，能應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 6．通過(guò)對(duì)12條miRNA候選分子進(jìn)行RT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)miRNA在不同組織中存在著特異性表達(dá)情況，如miRl57a、miR390、miR414a和miR395，分析結(jié)果表明這些miRNA分子在馬鈴薯生長(zhǎng)發(fā)育