RA促進(jìn)腸上皮Caco-2細(xì)胞間緊密連接的機(jī)制研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　第一部分：RA促進(jìn)腸上皮細(xì)胞Caco-2之間的緊密連接
　　目的：明確RA對(duì)Caco-2細(xì)胞緊密連接的促進(jìn)作用，篩選RA最佳作用濃度，探索RA信號(hào)通路中RARs與TLRs和緊密連接相關(guān)蛋白在RA促進(jìn)Caco-2細(xì)胞發(fā)揮屏障功能中的變化。
　　方法：利用電壓電阻儀檢測(cè)RA處理后的Caco-2細(xì)胞跨上皮電阻(TER)的變化。給予不同RA濃度(0.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μ

2、mol/L、20μmol/L)處理Caco-2細(xì)胞，Real-time PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)分析RA作用后Caco-2細(xì)胞中RARs、TLRs和緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)水平變化。免疫熒光染色觀察RA作用Caco-2細(xì)胞后關(guān)鍵受體RARβ的定位表達(dá)差異。
　　結(jié)果：RA處理顯著增加Caco-2細(xì)胞跨上皮電阻，與未處理組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01。不同濃度RA(0.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L

3、、10μmol/L、20μmol/L)分別處理Caco-2細(xì)胞后，Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示RARβ、TLR4和ZO-2的mRNA表達(dá)水平均較RA未處理組有明顯升高，且RA為1-10μmol/L時(shí)效果最為顯著(P＜0.05，P＜0.001);Western blot進(jìn)一步分析RARβ、TLR4和ZO-2三個(gè)蛋白表達(dá)水平變化，其結(jié)果與real-time PCR檢測(cè)分析完全一致。但不同濃度 RA對(duì)RARα、RARγ和TLR2，以

4、及Occludin、ZO-1的表達(dá)水平并沒有明顯的改變。同時(shí)，免疫熒光染色觀察到未經(jīng)RA處理的Caco-2細(xì)胞中RARβ多定位于細(xì)胞核膜周邊;隨著RA作用濃度的不斷升高，發(fā)現(xiàn)RARβ在胞漿中的表達(dá)逐漸增加，由核膜周邊聚集的RARβ逐漸移向胞漿。
　　結(jié)論：RA增加Caco-2細(xì)胞的跨上皮電阻，促進(jìn)其緊密連接，其機(jī)制可能是通過(guò)RARβ信號(hào)通路，上調(diào)TLR4和緊密連接蛋白ZO-2的表達(dá)水平，從而實(shí)現(xiàn)RA促進(jìn)腸上皮屏障的保護(hù)作用。

5、>　　第二部分：RARβ調(diào)節(jié)TLR4促進(jìn)Caco-2細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-2的表達(dá)
　　目的：利用Ad-RARβ和siRARβ重組腺病毒研究RARβ調(diào)控RA促進(jìn)Caco-2細(xì)胞緊密連接的作用，通過(guò)免疫共沉淀(Co-IP)和染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)探索RARβ、TLR4和ZO-2三者之間的相互作用關(guān)系，尋找RARβ促進(jìn)ZO-2表達(dá)的具體調(diào)控機(jī)制。
　　方法：重組Ad-RARβ和siRARβ腺病毒分別感染Caco-2細(xì)胞后，

6、Real-time PCR和Western blot檢測(cè)分析RARβ、TLR4和ZO-2三者的表達(dá)水平變化。通過(guò)免疫共沉淀(Co-IP)技術(shù)，分別利用RARβ抗體和ZO-2抗體免疫沉淀細(xì)胞中與之結(jié)合的蛋白，Western blot檢測(cè)發(fā)生免疫共沉淀的目的蛋白。運(yùn)用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)技術(shù)，通過(guò)RARβ抗體沉淀Caco-2細(xì)胞中DNA-蛋白交聯(lián)復(fù)合物，Real-time PCR檢測(cè)分析經(jīng)RARβ抗體富集的DNA序列表達(dá)水平的差異。

7、
　　結(jié)果：重組腺病毒Ad-RARβ感染Caco-2細(xì)胞后，Real-time PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，RARβ mRNA和蛋白表達(dá)水平均有明顯升高，較RFP對(duì)照組具有顯著性的差異，P＜0.001;同時(shí)TLR4和ZO-2的表達(dá)水平也隨之顯著性上調(diào);當(dāng)siRARβ感染阻斷RARβ的表達(dá)水平時(shí)，Caco-2細(xì)胞中TLR4和ZO-2的蛋白表達(dá)水平也隨之降低，較RFP對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.0

8、1）。Co-IP檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RARβ抗體可沉淀Caco-2細(xì)胞中TLR4蛋白，ZO-2抗體可沉淀細(xì)胞中TLR4蛋白，表明在Caco-2細(xì)胞中RARβ蛋白與TLR4蛋白相互結(jié)合，TLR4蛋白與ZO-2蛋白相互結(jié)合;但RARβ與ZO-2之間沒有蛋白-蛋白間的相互作用。進(jìn)一步利用ChIP技術(shù)研究表明，RARβ可與胞內(nèi)TLR4啟動(dòng)子區(qū)相結(jié)合，但與ZO-2啟動(dòng)子區(qū)不存在相互作用。
　　結(jié)論：利用重組腺病毒分別過(guò)表達(dá)和沉默RARβ，證實(shí)RA