基于雙發(fā)卡型和Y型結(jié)構(gòu)DNA構(gòu)建的電化學(xué)生物傳感器在Hg2+和ATP分析檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、快速、廉價(jià)、高選擇性和高靈敏度檢測(cè)與生命活動(dòng)相關(guān)的小分子與蛋白質(zhì)，與疾病相關(guān)的特征DNA序列以及重金屬污染物是現(xiàn)代生物化學(xué)研究的重要課題。近年來(lái)，隨著科技的不斷發(fā)展，DNA電化學(xué)生物傳感器作為一門新興的、涉及生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、電化學(xué)及信息技術(shù)等領(lǐng)域的交叉學(xué)科，已被廣泛應(yīng)用到基因診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、藥物研究等領(lǐng)域。DNA電化學(xué)生物傳感器是一類以核酸分子作為識(shí)別元素，以電極作為信號(hào)轉(zhuǎn)換器的生物傳感器。核酸分子探針具有特異性強(qiáng)、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、靶物質(zhì)分子

2、廣泛及易于大量化合成等優(yōu)點(diǎn)。DNA電化學(xué)生物傳感器結(jié)合了核酸探針的優(yōu)異性能和電化學(xué)檢測(cè)方法的高靈敏度特性，在現(xiàn)代生物傳感器研究領(lǐng)域中占主體地位。此外，關(guān)于發(fā)掘核酸修飾電極的新性能、設(shè)計(jì)與制備新型核酸探針、開發(fā)新型高效的DNA電化學(xué)傳感器的研究也越來(lái)越受到大家的關(guān)注。本論文基于DNA的雙發(fā)卡型和Y型結(jié)構(gòu)，通過(guò)結(jié)合比率法和核酸外切酶III輔助的信號(hào)循環(huán)放大策略構(gòu)建了四種新型電化學(xué)生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)汞離子和ATP的高靈敏高選擇性檢測(cè)。主要內(nèi)

3、容如下：
　　1.基于雙標(biāo)記的DNA雙發(fā)卡結(jié)構(gòu)和插入法構(gòu)建用于靈敏檢測(cè)ATP的電化學(xué)生物傳感器
　　本章基于雙標(biāo)記的雙發(fā)卡DNA及插入法構(gòu)建了一種用于檢測(cè)ATP的電化學(xué)適配體傳感器。首先將巰基和亞甲基藍(lán)（MB）標(biāo)記的適配體探針插入到電極表面修飾了二硫蘇糖醇（DTT）單分子層的金電極上，此時(shí)MB標(biāo)記的輔助探針能夠在電極表面與適配體探針進(jìn)行雜交形成雙發(fā)卡DNA結(jié)構(gòu)。在沒(méi)有ATP存在的情況下，這種穩(wěn)定的雙發(fā)卡結(jié)構(gòu)拉近了MB與電極表

4、面之間的距離，可以檢測(cè)到很強(qiáng)的電流信號(hào)。當(dāng)有ATP存在時(shí)，適配體探針與ATP之間的特異性結(jié)合使得適配體探針末端的MB遠(yuǎn)離電極表面，輔助探針離開電極，使檢測(cè)到的電流信號(hào)明顯降低。該傳感器檢測(cè)ATP的線性濃度范圍濃度為5nmol L-1-1μmol L-1，最低檢出限為1.4nmol L-1。
　　2.基于使用插入法和DNA雙發(fā)卡結(jié)構(gòu)作為信號(hào)放大技術(shù)構(gòu)建一種用于靈敏檢測(cè)汞離子的可再生電化學(xué)生物傳感器
　　本章研究了一種簡(jiǎn)單有效的

5、用于檢測(cè)汞離子的電化學(xué)生物傳感器。這種新穎的傳感器采用插入法將巰基標(biāo)記的DNA探針插入到已組裝了一層二硫蘇糖醇（DTT）分子的金電極表面上，提高了DNA探針間的雜交效率。文章中通過(guò)比較分析采用單發(fā)卡DNA結(jié)構(gòu)制備的電化學(xué)傳感器與采用雙發(fā)卡DNA結(jié)構(gòu)制備的電化學(xué)傳感器之間阻抗值的變化，發(fā)現(xiàn)雙發(fā)卡DNA結(jié)構(gòu)修飾的電化學(xué)傳感器具有更高的靈敏度，基于這個(gè)發(fā)現(xiàn)構(gòu)建了雙發(fā)卡DNA修飾的用于高靈敏檢測(cè)汞離子的電化學(xué)生物傳感器。該傳感器檢測(cè)汞離子的線性

6、濃度范圍為0.1nmol L L-1-5μmol L-1，最低檢出限為28pmol L-1.此外，該傳感器不僅具有良好的選擇性，而且具有良好的可再生性。
　　3.基于DNA在Y型與發(fā)卡型結(jié)構(gòu)之間的轉(zhuǎn)換制備的用于檢測(cè)Hg2+可再生比率式生物傳感器
　　本章結(jié)合比率法和Y型結(jié)構(gòu)DNA構(gòu)建了一種簡(jiǎn)單的，可靠的檢測(cè)Hg2+的電化學(xué)生物傳感器。在該工作中，首先將分別標(biāo)記了亞甲基藍(lán)和二茂鐵標(biāo)記的兩條DNA探針通過(guò)簡(jiǎn)單的退火處理讓其形成Y

7、型結(jié)構(gòu)的DNA。然后將制備好的Y型DNA利用Au-S鍵自組裝到電極表面，此時(shí)通過(guò)電化學(xué)方法測(cè)量可以觀察到一個(gè)很明顯的二茂鐵的電流信號(hào)和一個(gè)較為微弱的亞甲基藍(lán)的電流信號(hào)。最后將該傳感器與Hg2+后，由于T堿基與Hg2+間的特異性作用使得Y型DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榘l(fā)卡型結(jié)構(gòu)。在這個(gè)過(guò)程中，亞甲基藍(lán)逐漸靠近電極表面，二茂鐵隨著DNA探針離開電極表面。隨著Hg2+濃度的增加，所檢測(cè)到的亞甲基藍(lán)的電流信號(hào)逐漸增大，而二茂鐵的電流信號(hào)逐漸減小。利用這種信

8、號(hào)比率式電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)Hg2+的線性范圍為1nmol L-1-5μmol L-1，檢測(cè)限為0.094nmol L-1。
　　4.基于核酸外切酶III輔助放大信號(hào)構(gòu)建靈敏選擇性檢測(cè)Hg2+的可再生比率生物傳感器
　　本章研制一種基于核酸外切酶III（Exo III）輔助放大信號(hào)的可再生比率式生物傳感器，并成功應(yīng)用于Hg2+的高靈敏、高選擇性檢測(cè)。該傳感器首先將分別標(biāo)記了亞甲基藍(lán)和二茂鐵的兩條DNA探針在溶液中雜交形成Y型

9、DNA結(jié)構(gòu)，然后將其自組裝到電極表面，此時(shí)可以檢測(cè)到一個(gè)微弱的亞甲基藍(lán)的電流信號(hào)和一個(gè)較為明顯的二茂鐵的電流信號(hào)。在有Hg2+存在情況下，二茂鐵標(biāo)記的探針（Fc-probe）與溶液中的輔助鏈在Hg2+作用下形成雙螺旋結(jié)構(gòu)后離開電極表面，使Y型DNA轉(zhuǎn)變?yōu)橛蓡我坏膩喖谆{(lán)標(biāo)的探針（MB-probe）形成的發(fā)卡型結(jié)構(gòu)。此時(shí)，由于Exo III能選擇性剪切雙鏈結(jié)構(gòu)中的Fc-probe，釋放出的Hg2+和輔助探針能繼續(xù)與電極上的Y型DNA作用，