畢赤酵母基因打靶效率改造研究.pdf

1、廈門大學學位論文原創(chuàng)性聲明本人呈交的學位論文是本人在導師指導下，獨立完成的研究成果。本人在論文寫作中參考其他個人或集體已經發(fā)表的研究成果，均在文中以適當方式明確標明，并符合法律規(guī)范和《廈門大學研究生學術活動規(guī)范(試行)》。另外，該學位論文為(倆守、巷受)課題(組)的研究成果，獲得(伍1守專噎)課題(組)經費或實驗室的資助，在(嘀守毒虞)實驗室完成。(請在以上括號內填寫課題或課題組負責人或實驗室名稱，未有此項聲明內容的，可以不作特別聲明。

2、)聲明人(簽名)礫藻為；年占月I夕日摘要基因打靶技術是研究酵母分子生物學的重要工具，是研究特定基因功能或胞內蛋白相互作用的重要手段之一，模式酵母，如釀酒酵母或裂殖酵母，已經建立了較為有效的基因打靶系統(tǒng)。然而與模式酵母相比，巴斯德畢赤酵母的基因打靶效率低下，大大限制了其在基礎研究和工業(yè)上的應用。鑒于巴斯德畢赤酵母近十年在蛋白表達和化學品生產上日益廣泛的應用，本研究擬從分子水平改造畢赤酵母菌株，提高其基因打靶效率，以滿足其在基因工程和代謝工

3、程中改造的需求。為達到上述研究目的，主要采取以下兩個策略進行改造：1)通過提高靶細胞適應性來加強基因打靶效率。以參與巴斯德畢赤酵母GSll5糖基化途徑的OCHl基因敲除為例，首先通過一個輔助載體在GSll5細胞中備份表達OCHl基因，再對含有輔助載體的GSll5進行基因組上OCHl基因的敲除。OCHl基因作為畢赤酵母糖基化途徑的重要基因，其功能的缺失對細胞的生長造成很大影響，而通過輔助載體表達造成的OCHl基因冗余大大彌補了基因組上OC

4、Hl基因缺失菌株的生長缺陷。在使用相同同源臂長度的情況下，與傳統(tǒng)一步法敲除相比，巴斯德畢赤酵母GSll5基因組上OCHl基因的敲除陽性率提高了兩個數(shù)量級。同時，用相同的策略又對巴斯德畢赤酵母GSll5基因組上KU70和SGSl基因進行了敲除，發(fā)現(xiàn)基因置換效率都得到顯著提高，其中，KU70基因的敲除率提高到2倍，SGSl基因的敲除率提高了23倍。該研究為非傳統(tǒng)酵母提供了頑固基因敲除的有效策略，且表明基因敲除導致的功能缺失以及進一步引起的細

5、胞適應性下降是導致單倍體非傳統(tǒng)酵母基因打靶效率低下的重要因素。2)通過特定DNA復制相關基因的修飾來提高基因打靶效率?；谕粗亟M的基因打靶效率取決于DNA雙鏈缺口修復的兩個競爭途徑：同源重組(HR)和非同源重組(NHEJ)。通過對起始NHEJ途徑的KU70基因與調節(jié)HR途徑的SRS2和SGSl基因的敲除，得到這三個基因的敲除突變株，分別進行ARGl基因敲除并計算敲除陽性率，從而評價SRS2，KU70和SGSl敲除對同源重組基因置換效率