脂氧素A4通過(guò)Nrf-2調(diào)節(jié)氣道上皮細(xì)胞E-鈣粘蛋白表達(dá)緩解脂多糖吸入誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷.pdf

1、目的：急性肺損傷(Acute lung injury, ALI)最重要的發(fā)病機(jī)制是機(jī)體局部或全身失控性炎癥反應(yīng)。脂氧素(Lipoxin, LXs)是機(jī)體重要的內(nèi)源性促炎癥緩解脂類物質(zhì)。氣道上皮細(xì)胞是氣道屏障的重要組成部分，也是呼吸道受環(huán)境刺激后最先受累的靶細(xì)胞。脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)刺激肺組織分泌炎性介質(zhì)、產(chǎn)生活性氧(Reactive oxygen specials, ROS)、引起氣道上皮損傷是其導(dǎo)致

2、ALI的重要機(jī)制。本研究中，我們以小鼠及人氣道上皮細(xì)胞為研究對(duì)象，探討了LXs對(duì)LPS吸入誘導(dǎo)ALI的保護(hù)作用及其作用機(jī)制，特別是LXA4對(duì)氣道通透性的影響、對(duì)氣道上皮細(xì)胞鈣粘蛋白(E-cadherin)表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，以及這些調(diào)節(jié)作用與抗氧化核轉(zhuǎn)錄因子2(NF-E2-related factor2, Nrf2)的解離活化、轉(zhuǎn)位入核之間的聯(lián)系。
　　方法：
　　(1) LPS霧化吸入誘導(dǎo)小鼠ALI模型的建立：動(dòng)物經(jīng)戊巴比妥(

3、70mg/kg)腹腔注射麻醉后，霧化吸入LPS(200ug/ml)20min，8h后麻醉，收集肺泡灌洗液，進(jìn)行肺組織形態(tài)學(xué)分析，驗(yàn)證模型是否誘導(dǎo)成功；
　　(2)人氣道上皮細(xì)胞16HBE處理：16HBE分別用 LPS(100ug/ml)、LPS+LXA4(200nM)、LXA4(200nM)或?qū)φ杖軇┨幚?4h，觀察細(xì)胞E-cadherin的表達(dá)、ROS的產(chǎn)生以及上皮細(xì)胞連接的變化；
　　(3)低溫成像實(shí)驗(yàn)：ALI模型建立后

4、8h，麻醉小鼠，液氮冷凍，取肺組織進(jìn)行連續(xù)縱切，收集小鼠肺組織線粒體還原型輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)和氧化型輔酶黃素腺嘌呤二核苷酸(Flavin adenine dinucleotide, FAD)的熒光信號(hào)，監(jiān)測(cè)線粒體氧化還原狀態(tài)，探討LXA4對(duì)ALI小鼠肺組織線粒體氧化還原狀態(tài)的保護(hù)作用；
　　(4)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence re

5、sonance energy transfer, FRET)實(shí)驗(yàn)：將質(zhì)粒ECFP-Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein1, Keap1)和EYFP-Nrf2分別或共轉(zhuǎn)入16HBE細(xì)胞后，在蔡司710顯微鏡下監(jiān)測(cè)Nrf2與其抑制性的胞漿伴侶分子Keap1的解耦聯(lián)；
　　(5) Nrf2選擇性抑制劑SB203580和競(jìng)爭(zhēng)性抑制質(zhì)粒pDN-Nrf2處理：在LPS霧化吸入造模

6、之前，經(jīng)尾靜脈注射SB203580(5umol/kg)，觀察LXA4對(duì)小鼠ALI的保護(hù)作用是否被抑制；16HBE轉(zhuǎn)入質(zhì)?；蚣尤隨B203580(20uM)后，LPS以及LXA4對(duì)細(xì)胞E-cadherin的表達(dá)是否改變，及其表達(dá)是否與Nrf2的活化有關(guān)；
　　結(jié)果：
　　1、LXA4能有效保護(hù)霧化吸入LPS所誘導(dǎo)的小鼠ALI模型；
　　2、LXA4緩解LPS引起的氣道上皮細(xì)胞損傷，上調(diào)氣道上皮細(xì)胞E-cadherin的表

7、達(dá)；
　　3、LXA4抑制LPS誘導(dǎo)的ALI肺組織和氣道上皮細(xì)胞的ROS產(chǎn)生增加；
　　4、LXA4逆轉(zhuǎn)LPS吸入引起的小鼠肺組織線粒體氧化還原失衡狀態(tài)；
　　5、LXA4通過(guò)促進(jìn)16HBE細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白Ser40位磷酸化促使其解離活化；
　　6、Nrf2介導(dǎo)了LXA4對(duì)16HBE細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用；
　　7、Nrf2介導(dǎo)了LXA4對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI模型小鼠氣道上皮細(xì)胞E-ca