利用人工鋅指蛋白技術(shù)提高釀酒酵母乙酸耐性.pdf

1、乙酸是乙醇發(fā)酵的主要副產(chǎn)物之一，也是纖維質(zhì)原料水解液中一種主要的發(fā)酵抑制物。當(dāng)乙酸濃度高達(dá)一定程度時(shí)，釀酒酵母細(xì)胞活性、生物量積累以及糖的利用都受到明顯抑制，高濃度乙酸也會(huì)造成細(xì)胞程序性死亡，影響纖維素乙醇發(fā)酵效率。鋅指蛋白(Zinc Finger Protein，ZFP)在基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程中有著非常重要作用，可以同時(shí)調(diào)控多基因表達(dá)。對(duì)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行人工設(shè)計(jì)和改造得到的人工轉(zhuǎn)錄因子(Artificial TranscriptionFac

2、tor, ATF)，包括對(duì)人工鋅指區(qū)基序及其排列順序進(jìn)行設(shè)計(jì)和改造得到的人工鋅指蛋白，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、藥物設(shè)計(jì)以及基因治療等領(lǐng)域，但是，利用人工鋅指蛋白改造工業(yè)微生物菌種方面的應(yīng)用研究還不夠深入。
　　本文首先將含有人工鋅指蛋白編碼基因的人工轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)載體文庫(kù)(ATFs)轉(zhuǎn)入實(shí)驗(yàn)室酵母S288c中，篩選得到一株具有較強(qiáng)的乙酸耐受性的突變體，進(jìn)一步分離得到與乙醇和乙酸耐性提高相關(guān)的人工轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)載體pRS316-M01

3、。將pRS316-M01轉(zhuǎn)入工業(yè)釀酒酵母Sc4126，重組酵母轉(zhuǎn)化子的乙醇和乙酸耐受性有明顯提高。在5 g/L乙酸脅迫條件下，Sc4126-M01表現(xiàn)出延滯期縮短、葡萄糖消耗速率以及乙醇發(fā)酵速率加快的優(yōu)良性能，發(fā)酵后期碳源缺乏條件下，該菌株還可以利用培養(yǎng)基中的乙酸進(jìn)行二次生長(zhǎng)。
　　為了探究人工鋅指蛋白ZFP-M01提高酵母乙酸耐性機(jī)理，用不同濃度乙酸沖擊含有ZFP-M01編碼基因的菌株Sc4126-M01（以下簡(jiǎn)稱鋅指菌）及含有

4、空載體的對(duì)照菌株，發(fā)現(xiàn)含有人工轉(zhuǎn)錄因子的鋅指菌Sc4126-M01具有更高過(guò)氧化氫酶(CAT)活力和較低的還原型谷胱甘肽及氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)比值。在沒有乙酸存在時(shí)，鋅指菌具有較低超氧化物歧化酶(SOD)活力，乙酸沖擊后，其SOD酶的酶活也低于對(duì)照菌株。推測(cè)鋅指蛋白的表達(dá)使細(xì)胞具有更強(qiáng)的清除過(guò)氧化氫能力，能夠避免過(guò)氧化氫對(duì)細(xì)胞的傷害，保持細(xì)胞的穩(wěn)定性。
　　利用人工鋅指蛋白的保守結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)釀酒酵母基因組序列進(jìn)行了分

5、析，預(yù)測(cè)了可能受到ZFP-M01的調(diào)控的靶點(diǎn)基因。實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)分析結(jié)果表明，在乙酸脅迫條件下，鋅指菌Sc4126-M01細(xì)胞中QDR3，IKS1和YFL040W基因表達(dá)發(fā)生明顯下調(diào)。將三個(gè)基因分別敲除后，QDR3基因敲除子表現(xiàn)出乙酸耐受性增強(qiáng)，IKS1基因敲除子在高濃度乙醇和乙酸沖擊后，存活率有明顯提高，而YFL040W具有更高氧化脅迫耐受性。對(duì)乙酸耐性提高的QDR3和IKS1突變體進(jìn)行了進(jìn)一步的液體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，在不同