牡蠣蛋白肽的酶法制備及其改善小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的研究.pdf

1、本研究以近江牡蠣為原料，選用中性蛋白酶水解牡蠣蛋白制備牡蠣蛋白酶解肽；初步探討改善學(xué)習(xí)和記憶功能與抗氧化活性之間的聯(lián)系；采用膜分離、凝膠層析分離等技術(shù)對牡蠣蛋白酶解肽進(jìn)行分離純化；探討了超濾組分對東莨菪堿所致學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠的改善功能及機(jī)制，最后對分離組分的理化特性及PC12細(xì)胞活性進(jìn)行研究。旨在提高牡蠣蛋白資源利用率，開發(fā)新的功能食品，為牡蠣資源高值化利用開辟新途徑。
　?。?）研究前處理方法、E/S、pH值、溫度和時間對中性蛋

2、白酶水解牡蠣蛋白的影響，制備牡蠣蛋白酶解肽（EHOP），分析其分子量分布，體外試驗(yàn)測定其抗氧化活性。結(jié)果表明：酶解前100℃熱處理10min能夠提高酶解液中蛋白肽的含量，E/S為2.0％、pH7.0、溫度50℃、時間3.0h為酶解的適宜條件，其DH達(dá)到14.95%，所制備的EHOP的主要成分為小分子肽類物質(zhì)，分子量主要集中在500～3091Da。EHOP的還原性較強(qiáng)，對?OH和超氧陰離子自由基均有較好的清除能力，EHOP濃度為25mg/

3、mL時，其還原力A700為0.44，?OH清除率和超氧自由基清除率分別達(dá)到21.2%和68.9%。
　?。?）采用動物實(shí)驗(yàn)探討EHOP改善小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力及其抗氧化活性。EHOP按劑量5g/kg.d給4周齡小鼠灌胃4周后，通過Morris水迷宮方法考察了EHOP對小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶功能的影響，并檢測小鼠血漿、肝組織和腦組織中SOD活性及MDA含量。結(jié)果表明，與空白組相比，EHOP組小鼠的潛伏期（18.97±3.84s）明顯縮

4、短，采用空間搜索策略的比例、穿越平臺的次數(shù)、目標(biāo)象限停留的時間和路程均有不同程度的增加，證實(shí)EHOP具有顯著改善小鼠學(xué)習(xí)和記憶功能。與空白組相比，EHOP能夠顯著增強(qiáng)小鼠肝組織中SOD活性（P<0.005），顯著性減少腦組織及血漿中的MDA含量均（P<0.005），結(jié)果顯示，EHOP體內(nèi)抗氧化活性同改善記憶能力有相關(guān)性。
　?。?）采用超濾法對EHOP進(jìn)行純化，得到組分A（＞10kDa）、組分B（10KDa～5kD）和組分C（<5

5、kDa）三個組分，腹腔注射東莨菪堿建立急性學(xué)習(xí)記憶障礙模型，采用Morris水迷宮考察了超濾組分對東莨菪堿所致學(xué)習(xí)記憶障礙的改善功能，并通過測定小鼠大腦中MDA含量、SOD活性、MAO活性和AchE活性，初步探討了其改善學(xué)習(xí)記憶機(jī)理。結(jié)果表明：與模型組相比，各給藥組小鼠潛伏期明顯降低，其中H-組分B和 L-組分C對實(shí)驗(yàn)小鼠的空間學(xué)習(xí)能力提高效果較為明顯；空間探索試驗(yàn)中，H-組分B和H-組分C對東莨菪堿致記憶障礙小鼠的記憶保持能力有一定的

6、改善作用。與模型組相比，高、低劑量的組分B和組分C均能顯著降低小鼠大腦中的MDA含量（P<0.05），而僅H-組分A組的SOD活力顯著提高（P<0.05），其余各組沒有顯著差異（P>0.05）；與模型組相比，各給藥組的AChE活力顯著性降低（P<0.05），且與陽性對照組相比沒有現(xiàn)在差異（P<0.05）；相對于模型組，僅L-組分A組、H-組分A和L-組分C組的MAO活力顯著降低（P<0.05），其余各組均作用不顯著（P>0.05）。

7、r>　?。?）采用凝膠層析法對組分C組分進(jìn)一步分離純化；以低分化的PC12細(xì)胞及H2O2損傷的PC12細(xì)胞模型作為研究對象，顯微鏡觀察EHOP、組分C及分離組分P1、P2、P3、P4對PC12細(xì)胞的生長增殖、分化的影響，采用MTT法測定其存活率，研究EHOP及其分離組分對氧化損傷細(xì)胞的修復(fù)和保護(hù)作用。結(jié)果如下：Sephadex G-25的分離條件為：超純水作流動相，流速1.0ml/min，上樣量0.5ml，柱壓0.03MPa；組分C分離

8、可得到四個組分，其中P3含量最高。高劑量組（800ug/mL）和低劑量組（400ug/mL）的EHOP和P3均能顯著提高細(xì)胞的存活率（P<0.05），而其余實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，結(jié)果無明顯差別（P>0.05）。800ug/mL的EHOP、組分C和P3組分誘導(dǎo)PC12細(xì)胞7天后，未見有明顯的突起長出，細(xì)胞形態(tài)沒有顯著性差異，但與空白組相比，其生長密度明顯增大，具有提高細(xì)胞的生長增殖能力。另外，800ug/mL的P3組分對H2O2損傷細(xì)胞具有

9、顯著的保護(hù)修復(fù)作用，細(xì)胞存活率分別從（57.57±0.90）%提高至（61.06±1.22）%(P<0.05)。
　　總結(jié)論：本研究證實(shí)了熱處理能夠提高酶解活性肽的效率，酶解制備的牡蠣蛋白酶解物（EHOP）的主要成分為低分子肽類物質(zhì)，體外試驗(yàn)表明EHOP具有良好的抗氧化活性。動物試驗(yàn)結(jié)果表明，EHOP具有改善正常小鼠及東莨菪堿所致障礙小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，且抗氧化活性強(qiáng)，其作用機(jī)理可能與清除自由基、降低腦組織氧化損傷作用密切聯(lián)系，與