斑馬魚中受生物鐘調(diào)控及光應答的轉(zhuǎn)錄因子E4bp4-2b通過D-box抑制cry1aa的表達.pdf

1、生物鐘是生物體內(nèi)的計時機制，在生理、生化和行為等水平調(diào)節(jié)生物體的生命活動。生物鐘的異?？梢詫е率?、精神障礙甚至癌癥等許多疾病。生物鐘調(diào)節(jié)的分子機制主要是CLOCK:BMAL1異二聚體做為正向調(diào)節(jié)因子綁定到負向調(diào)節(jié)因子（per，cry）的啟動子區(qū)域的E-box，啟動負向調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)錄。負向調(diào)節(jié)因子在細胞漿內(nèi)翻譯后，形成PER:CRY異二聚體，入核與CLOCK:BMAL1相互作用，解除了CLOCK:BMAL1的轉(zhuǎn)錄激活作用，完成一個周期的

2、運行。
　　在雞和小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，E4bp4作為亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，能夠識別綁定生物鐘基因的D-box元件抑制其表達，由此參與生物鐘調(diào)節(jié)。在斑馬魚中，由于基因組的大復制，存在六個e4bp4的同源基因。斑馬魚e4bp4如何參與生物鐘調(diào)節(jié)目前尚不清楚。本研究深入研究了其中的e4bp4-2b（e4bp4-5）。
　　熒光定量PCR的方法表明，在LD（light/dark）和DD（dark/dark）的情況下，e4bp4-2b呈現(xiàn)

3、轉(zhuǎn)錄振蕩。并且原位雜交分析顯示，e4bp4-2b主要表達斑馬魚的腦部。啟動子分析發(fā)現(xiàn)在斑馬魚e4bp4-2b的啟動子區(qū)域擁有幾個E-like boxes。雙報告熒光素酶實驗展示e4bp4-2b啟動子活性可以被Bmal1b和Clock1a復合體所激活，但被Cry1aa所抑制。ChIP實驗顯示，Bmal1b可以結(jié)合e4bp4-2b啟動子上的E-like boxes。這些研究結(jié)果揭示了生物鐘直接調(diào)控斑馬魚中e4bp4-2b。
　　基于在

4、光暗條件下e4bp4-2b的表達有明顯的差異，我們提出了其受光控的假設。光照實驗揭示了e4bp4-2b表達確實受光上調(diào)。e4bp4-2b啟動子區(qū)域的含有可能接受光應答的重要元件D-box。熒光素酶檢測展示了Tefa可以促進e4bp4-2b的表達。然而光是如何通過這個元件傳遞對該基因的調(diào)控尚需深入研究。
　　為了探究 e4bp4-2b在斑馬魚生物鐘中的作用，我們利用 TALEN的技術(shù)構(gòu)建了兩種e4bp4-2b突變體系。qRT-PCR

5、實驗展示了e4bp4-2b的突變導致幾個斑馬魚生物鐘核心基因cry1aa、per2、cloack1a以及bmal1b上調(diào)。行為實驗展示了，在LD條件下，e4bp4-2b突變體的活動量與野生型相比顯著下調(diào)。我們深入研究了E4bp4-2b對cry1aa調(diào)節(jié)機制。細胞轉(zhuǎn)染實驗展示了e4bp4-2b可以通過cry1aa啟動子區(qū)域的D-box來抑制cry1aa的表達。ChIP實驗表明E4bp4-2b能夠結(jié)合cry1aa的D-box。采用e4bp4

6、-2b突變體的全長cDNA做細胞轉(zhuǎn)染實驗，發(fā)現(xiàn)它喪失了其抑制功能。這些研究結(jié)果表明E4bp4-2b為斑馬魚生物鐘調(diào)節(jié)所必須，特別是通過D-box負向調(diào)控cry1aa。
　　對于突變體樣本選取 ZT2和 ZT14兩個時間點做深度測序。測序結(jié)果顯示出200余個基因與野生型樣品相比存在顯著性差異表達。并且這些基因中存在兩個時間點同時上調(diào)或者下調(diào)的基因68個。我們查閱這些基因相關(guān)的功能并選取其中四個（eva1a、col28a、capn2和

7、 muc5ac）可能與e4bp4-2在癌癥生成以及發(fā)育方面有關(guān)的基因做實時定量PCR實驗驗證了深度測序的結(jié)果。為揭示e4bp4-2b在斑馬魚中關(guān)于癌癥的發(fā)生和發(fā)育的功能和尋找其他下游靶基因做出了貢獻。
　　總之，我們的研究展示了e4bp4-2b在斑馬魚中是受生物鐘調(diào)控的，并且對于調(diào)控生物鐘方面也是必不可少的。而且它的表達同時受到光的調(diào)控。E4bp4-2b可以通過綁定在cry1aa基因啟動子區(qū)域的D-box上負向調(diào)控其轉(zhuǎn)錄水平。并且