氨甲?；D(zhuǎn)移酶Asm21在安絲菌素合成中的雙重催化功能研究.pdf

1、美登素是強力抗癌藥物,通過破壞微管組裝發(fā)揮其細胞毒性。與抗體結(jié)合的靶向美登素分子的腫瘤選擇性更強,半衰期更長,目前處于不同的臨床實驗期,發(fā)展勢頭良好。Actinosynnemapretiosum ssp.Auranticum ATCC31565產(chǎn)生的安絲菌素是微生物來源的美登素分子。在多個不同組分中,安絲菌素P-3是活性最強的主要組分,它的生物合成途徑以3-氨基-5-羥基苯甲酸(AHBA)作為起始單元,隨后在l型聚酮合酶的催化下加載7個

2、延伸單元得到19元人環(huán)內(nèi)酰胺proansamitocin,最后經(jīng)過氯代、甲基化、酰基化、氨甲?；?、環(huán)氧化等一系列的后修飾反應得到安絲菌素。
　　 近年來,從ATCC31565的固體發(fā)酵產(chǎn)物中分離到了一系列安絲菌素糖苷.AGP-1、AGP-2和AGP-3,它們在酰胺Ⅳ的位置攜帶了β-D-葡萄糖基團。與此同時,Snipes等從Amycolatopsis sp.CP2808中也分離到了一系列攜帶氨甲?；咸烟腔臉O性安絲菌素糖苷。最近

3、,我們的合作者在ATCC31565中同樣發(fā)現(xiàn)了葡萄糖基C-4羥基發(fā)生氨甲酰化的安絲菌素糖苷(ACGP-3)。本研究組己經(jīng)證實該糖基化反應是由N-糖基轉(zhuǎn)移酶Asm25負責的,而這一系列氨甲?；擒招庐a(chǎn)物的發(fā)現(xiàn),促使我們?nèi)ふ邑撠熎咸烟前奔柞；幕蚝兔浮?br>　　 利用本研究組積累的多個安絲菌素生物合成基因缺失突變株,通過靜息細胞轉(zhuǎn)化實驗,我們可以初步確定,糖苷葡萄糖基的氨甲?；怯砂奔柞；D(zhuǎn)移酶Asm21來負責的。而在前期的研究中,

4、通過序列同源性比對以及基因缺失實驗,已經(jīng)初步證明位于安絲菌素生物合成基因簇中的asm21負責C-7氨甲酰化和嗯嗪環(huán)的形成。那么在安絲菌素的生物合成中,Asm21就具有雙重催化的功能,不僅催化骨架的氨甲?；?同時也催化葡萄糖基上的氨甲?；?與其他次級代謝中的氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶有很大的不同,因此本研究對它進行了全面的研究。
　　 通過基因失活和一系列的回補實驗,不僅證明asm21確實參與了安絲菌素的合成,而且重新定義了asm21功能基因

5、的長度。除了之前已經(jīng)報道過的19-chloroproansamitocin之外,我們從asm21基因缺失突變株(BLQ16)的固體培養(yǎng)物中還分離得到了三個新的中間產(chǎn)物,并通過核磁共振分別確定了它們的結(jié)構(gòu)。這三個新化合物分別為14-β-hydroxy-20-O-methyl-19-chloroisoproansamitocin、14-α-hydroxy-20-O-methyl-19-chloroisoproansamitocin和20-O

6、-methyl-19-chloroproansamitocin,它們都缺失了C-7氨甲?；?。其中20-O-methyl-19-chloroproansamitocin是主要產(chǎn)物,并被用作底物來檢驗異源表達的Asm21蛋白的酶學性質(zhì)。以氨甲酰磷酸作為供體,在Mg2+和ATP存在的情況下,確定Asm21的最適溫度、pH及金屬離子分別為37℃、pH8.5和10 mM Mg2+。Asm21對20-O-methyl-19-chloroproans

7、amitocin和19-chloroproansamitocin的Km值分別為25.2±8.7μM和78.7±18.8μM,表明它對主要產(chǎn)物20-O-methyl-19-chloroproansamitocin的親和力更強,以它為天然底物。
　　 前期研究通過包涵體復性得到了Asm25的蛋白,而我們通過使用新的載體和表達條件,純化得到了N-糖基轉(zhuǎn)移酶Asm25的可溶活性蛋白,并通過酶促反應催化從Ⅳ-去甲基安絲菌素P-3(PND-

8、3)制備得到AGP-3,以此作為Asm21體外反應的底物。純化的Asm21蛋白同樣也可以催化AGP-3的氨甲?；瘡亩玫紸CGP-3。Asm21對糖苷AGP-3的Km值為135.3±38.4μM,遠遠高于另外兩個底物,表明Asm21更傾向與聚酮骨架結(jié)合。然而,Asm21對于糖苷的整體催化效率要高于聚酮骨架底物。最后,我們不僅在體外實現(xiàn)了Asm21的雙重催化以及它與Asm25的串聯(lián)催化,而且通過靜息細胞體系將20-O-methyl-19-

9、chloroproansamitocin同時轉(zhuǎn)化為安絲菌素P-3及氨甲?；奶擒誂CGP-3,在體內(nèi)天然條件下也重現(xiàn)了這個過程。
　　 本研究是第一次對具有高度底物靈活性的抗生素O-氨甲?；D(zhuǎn)移酶進行的深入的生化研究,并在體內(nèi)和體外同時實現(xiàn)了氨甲?；D(zhuǎn)移酶的雙重催化以及它與糖基轉(zhuǎn)移酶的串聯(lián)催化。值得注意的是,這個酶不僅催化大環(huán)內(nèi)酰胺骨架上的C-7氨甲?；?接受類似的安絲菌素中間產(chǎn)物為底物,同時也負責安絲菌素糖苷的C-4羥基的氨甲

10、?；?。因此,安絲菌素的生物合成途徑通過N-糖基轉(zhuǎn)移酶Asm25和O-氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶Asm21的串聯(lián)催化得到了延伸。由于其廣泛的底物范圍及氨甲?；鶎τ诳股鼗钚缘闹匾?Asm21可能被用來得到新的氨甲酰化抗生素衍生物,從而為新藥物的開發(fā)提供工具。
　　 安莎類抗生素及其他來源于AHBA(3-氨基-5-羥基苯甲酸)的抗生素在臨床上具有非常重要的意義,它們分別具有很強的抗細菌、抗真菌或者抗腫瘤活性。在重要抗結(jié)核藥物利福霉素的生物合成

11、研究中,AHBA的合成途徑得到了全面而深入的研究。其中AHBA合酶RifK催化最后一步從aDHS到AHBA的轉(zhuǎn)化,而且這個蛋白與其他安莎類抗生素生物合成基因簇中的同源蛋白的相似性非常高。另一方面,以抗糖尿病藥物阿卡波糖和抗真菌抗生素井岡霉素(有效霉素)為代表的C7N氨基環(huán)醇家族天然產(chǎn)物,它們都含有C7N氨基環(huán)醇的核心結(jié)構(gòu)。這些化合物的生物合成途徑共同起始于7-磷酸景天庚酮糖到2-表-5-表-有效醇酮的環(huán)化(2-epi-5-epi-val

12、iolone),這個反應是由磷酸糖環(huán)化酶(井岡霉素中為Va1A,阿卡波糖中為AcbC)催化的,之后2-表-5-表-有效醇酮經(jīng)由不同的催化路徑被轉(zhuǎn)化為不同的終產(chǎn)物。不同基因簇中AHBA合酶和環(huán)化酶序列之間高度的保守性使得我們可以根據(jù)CODEHOP原則設計簡并引物,然后從放線菌菌種庫中篩選潛在的基因資源,為進一步得到新活性抗生素提供條件和基礎(chǔ)。最終,從實驗室小型菌種庫中共獲得7株AHBA合酶基因陽性菌株,3株環(huán)化酶基因陽性菌株,并通過克隆測

13、序驗證了擴增序列的正確性,比較了與己知基因的同源性。
　　 從環(huán)化酶基因陽性菌株之一Streptomyces sp.CS中擴增得到的DNA片段所編碼的氨基酸序列與ValA及AcbC的同源性都比較高,分別為58％和52％。隨后,通過構(gòu)建基因組文庫和篩選,得到了13個包含環(huán)化酶探針片段的相互重疊的陽性fosmids。其中,選擇16H9進行測序,通過Frameplot3.0和BLASTp分別預測編碼框和比對蛋白同源性,發(fā)現(xiàn)了20多個開

14、放閱讀框(ORF)。令人感興趣的是,ORF16-20聚集成簇排列,分別與AcbC、AcbM、AcbL、AcbN及AcbO存在較高同源性,同時與這五個基因在阿卡波糖生物合成基因簇中的成簇分布是一樣的。這五個基因催化阿卡波糖生物合成途徑的前五步反應,也就是從7-磷酸景天庚酮糖合成7-磷酸-1-表-有效烯醇。7-磷酸-1-表-有效烯醇與先前報道的CS鏈霉菌中分離得到的C7多羥基環(huán)己烷衍生物CSS的結(jié)構(gòu)非常接近。將基因簇中的CS-valA基因敲