鱖魚(yú)胰蛋白酶分離純化、性質(zhì)鑒定及分子克隆.pdf

1、胰蛋白酶(Trypsin，EC 3.4.21.4)是絲氨酸蛋白酶家族中一種專門水解蛋白質(zhì)賴氨酸(Lys)殘基和精氨酸(Arg)殘基的肽鏈內(nèi)切酶，在魚(yú)體內(nèi)起著重要的生理和消化功能。在低溫下仍然具有高活性的魚(yú)體胰蛋白酶對(duì)食品加工行業(yè)具有重要意義。但是，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于淡水魚(yú)胰蛋白酶的報(bào)道很少。本課題首次以淡水鱖魚(yú)為研究對(duì)象，對(duì)其幽門垂胰蛋白酶進(jìn)行了分離純化，研究其酶學(xué)性質(zhì)，并對(duì)胰蛋白酶進(jìn)行了分子克隆，為今后研究淡水魚(yú)類胰蛋白酶的生理功能、消化

2、功能以及這類酶在食品加工中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。 本課題分離純化胰蛋白酶的方法包括硫酸銨分級(jí)鹽析、DEAE-Sephacel陰離子交換層析、Sephacryl S-200凝膠過(guò)濾層析、Q-Sepharose陰離子交換層析和SP-Sepharose陽(yáng)離子交換層析等。本研究得到了兩種類型的胰蛋白酶即陰離子型胰蛋白酶Trypsin A和陽(yáng)離子型胰蛋白酶Trypsin B。 SDS-PAGE、Native-PAGE和Casein

3、-zymography結(jié)果表明Trypsin A和Trypsin B 都得到了高度純化并且都是單體結(jié)構(gòu)。SDS-PAGE顯示Trypsin A和 Trypsin B的分子量分別為21kDa和21.5 kDa。用Boc-Phe-Ser-Arg-MCA為底物，二者的最適溫度分別為35和40 ℃，最適pH值均為pH8.5。熱穩(wěn)定性與pH值穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，Trypsin A和Trypsin B 在45 ℃以下加熱30 min可保持其活性，pH值

4、的耐受范圍為4.5至11.0。抑制劑實(shí)驗(yàn)表明絲氨酸類蛋白酶抑制劑都可以對(duì)這兩種胰蛋白酶強(qiáng)烈抑制，并且兩種酶的抑制效果相似。底物特異性實(shí)驗(yàn)表明Trypsin A和Trypsin B對(duì)熒光底物Boc-Phe-Ser-Arg-MCA的分解能力最強(qiáng)。金屬離子實(shí)驗(yàn)表明，這兩種胰蛋白酶可被一定濃度范圍的Ca2+和Mg2+離子激活，而被Fe2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Al3+、Ba2+和Co2+離子在一定程度上抑制。動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，以Boc-

5、Phe-Ser-Arg-MCA為底物，Trypsin A與Trypsin B的Km值分別為2.18和1.88 μM，所對(duì)應(yīng)的KcatS值分別為81.6和111.3 s-1。免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，鱖魚(yú)胰蛋白酶可以和抗鯉魚(yú)胰蛋白酶抗體呈陽(yáng)性反應(yīng)。氨基酸測(cè)序結(jié)果表明，Trypsin B的N-末端氨基酸序列為IVGGYECEAH，該序列和來(lái)自其它魚(yú)氨基酸序列有高度的同源性。 在分子克隆工作中，以胰蛋白酶保守位點(diǎn)及已測(cè)序的胰蛋白酶Trypsi

6、n B的N-末端氨基酸序列為依據(jù)設(shè)計(jì)引物，利用3' RACE、5' RACE及RT-PCR的方法得到了兩條編碼鱖魚(yú)胰蛋白酶的基因序列，并分別命名為TRS-A與TRS-B，基因序列的GenBank 登錄號(hào)分別為EU688996和EU688997，相應(yīng)的氨基酸序列GenBank登錄號(hào)為ACD70339與ACD70340。 TRS-A的cDNA全長(zhǎng)為869 bp，該序列包括一個(gè)23 bp的5'非編碼區(qū)，729 bp的開(kāi)放閱讀框和117

7、 bp的3'非編碼區(qū)，開(kāi)放閱讀框編碼242個(gè)氨基酸，其中222個(gè)氨基酸組成成熟蛋白區(qū)域，有15個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和5個(gè)氨基酸組成的激活肽，成熟蛋白分子量為24111.16 Da。TRS-B的cDNA全長(zhǎng)為885 bp，該序列包括23 bp的5'非編碼區(qū)，729 bp的開(kāi)放閱讀框和133 bp的3'非編碼區(qū)。和TRS-A一樣，TRS-B的開(kāi)放閱讀框編碼242個(gè)氨基酸，其中222個(gè)氨基酸組成成熟蛋白區(qū)域，有15個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和5個(gè)氨基酸組成