轉(zhuǎn)錄因子FoxA1對(duì)干細(xì)胞多能性基因Nanog的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究.pdf

1、胚胎干細(xì)胞具有在體外自我更新和分化成所有三胚層來源的細(xì)胞的能力。廣義上的胚胎干細(xì)胞包括：一.從機(jī)體幼稚生殖細(xì)胞發(fā)生癌變形成的惡性畸胎瘤建立的胚胎癌細(xì)胞（embryonal carcinoma cell，EC細(xì)胞）；二.從囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)建立的胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ES細(xì)胞）；三.從胚胎性腺區(qū)的原始生殖細(xì)胞建立的胚胎生殖細(xì)胞（embryonic germ cell，EG細(xì)胞）。胚胎干細(xì)胞的多能性主要依靠以O(shè)ct

2、4，Nanog，Sox2為核心的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)來維持。
　　本文主要以P19胚胎癌細(xì)胞（EC細(xì)胞）為模型，研究干細(xì)胞在維甲酸（retinoic acid, RA）誘導(dǎo)的分化過程中的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。P19細(xì)胞具有多能性，注射到囊胚期胚胎中能形成嵌合體動(dòng)物、注射到裸鼠皮下能形成具有三胚層結(jié)構(gòu)的畸胎瘤；在體外，能被誘導(dǎo)分化成胚胎所有三胚層來源的細(xì)胞。因此，P19細(xì)胞是研究多能干細(xì)胞分化調(diào)控機(jī)制的良好模型。
　　本文著重研究轉(zhuǎn)錄因子

3、FoxA1在干細(xì)胞分化過程中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。FoxA1是Forkhead Box轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，參與胚胎發(fā)育中細(xì)胞增殖與分化的調(diào)節(jié)。由于能夠結(jié)合高度壓縮的染色質(zhì)，并引導(dǎo)其它轉(zhuǎn)錄因子與染色質(zhì)的結(jié)合，F(xiàn)oxA1被稱為“先鋒”轉(zhuǎn)錄因子。過去的研究發(fā)現(xiàn)，在RA誘導(dǎo)的P19細(xì)胞分化過程中，F(xiàn)oxA1表達(dá)迅速被激活；多能性相關(guān)基因表達(dá)迅速下降，如Nanog；而分化相關(guān)基因表達(dá)依次被激活，如早期神經(jīng)發(fā)生相關(guān)基因Shh，神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin

4、。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxA1直接激活了Shh的表達(dá)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在P19細(xì)胞中單獨(dú)過表達(dá)FoxA1，可激活Nestin表達(dá)，并導(dǎo)致Nanog蛋白水平的下降。本文從表觀遺傳學(xué)角度，探索轉(zhuǎn)錄因子FoxA1在RA誘導(dǎo)的干細(xì)胞分化過程中對(duì)多能性基因Nanog的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并得到了以下結(jié)果：
　　一.檢測了RA誘導(dǎo)前后多能性標(biāo)志基因Nanog的表達(dá)水平及表觀遺傳修飾狀態(tài)的變化。RA處理P19細(xì)胞后， Nanog的mRNA及蛋白水平均迅速下調(diào)；

5、同時(shí)，我們考察了表觀遺傳修飾狀態(tài)包括組蛋白H3乙?；℉3K9ac）修飾、組蛋白H3K4甲基化(H3K4me2)修飾、組蛋白H3K27(H3K27me3)甲基化修飾和DNA甲基化修飾。研究發(fā)現(xiàn)，在未分化狀態(tài)， Nanog基因的組蛋白修飾狀態(tài)表現(xiàn)為H3K9高度乙酰化，H3K4高度甲基化，H3K27低甲基化；RA誘導(dǎo)兩天后，H3K9被去乙?；?，H3K4甲基化程度降低， H3K27高度甲基化。DNA甲基化方面，在未分化的P19細(xì)胞中，Nano

6、g啟動(dòng)子區(qū)域呈現(xiàn)低甲基化；RA處理四天后，Nanog啟動(dòng)子區(qū)域被高度甲基化。
　　二.發(fā)現(xiàn)在RA誘導(dǎo)過程中，F(xiàn)oxA1和Grg3直接結(jié)合于Nanog基因的增強(qiáng)子，并抑制Nanog的表達(dá)。根據(jù)過去的研究結(jié)果，猜測FoxA1直接抑制Nanog基因的表達(dá)。有文獻(xiàn)報(bào)道FoxA1可能募集轉(zhuǎn)錄輔抑制子Grg3，通過mRNA和蛋白水平檢測，發(fā)現(xiàn)，在RA誘導(dǎo)前后的P19細(xì)胞中，Grg3保持穩(wěn)定表達(dá)。通過染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)，在RA

7、處理兩天時(shí)FoxA1與Grg3同時(shí)結(jié)合于Nanog基因上游-2kb附近區(qū)域。此外，在RA處理P19細(xì)胞時(shí)，分別干擾FoxA1和Grg3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)RA處理兩天后， Nanog仍然維持表達(dá)。
　　三.探索了FoxA1抑制Nanog表達(dá)的細(xì)節(jié)分子機(jī)制。通過凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（EMSA）確認(rèn)FoxA1結(jié)合Nanog增強(qiáng)子-2025bp至-2001bp區(qū)域，而Grg3單獨(dú)不能結(jié)合DNA；通過免疫共沉淀（Co-IP）與免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)了F