骨髓干細(xì)胞移植治療心肌梗死電生理學(xué)機(jī)制的實驗研究.pdf

1、目的心血管疾病是危害人類健康的嚴(yán)重疾病，尤其是心肌梗死所致的細(xì)胞壞死及壞死后的心室重構(gòu)、斑痕形成是導(dǎo)致心力衰竭和死亡的主要病因。但目前的藥物治療和介入方法均無法修復(fù)已經(jīng)壞死的心肌組織，同種異體心臟移植也存在諸多限制，難以廣泛開展?；诖?，細(xì)胞心肌成形術(shù)(celluarcardiomyoplasty)即細(xì)胞移植(cellular transplantation)采用生物學(xué)技術(shù)將多種組織來源的細(xì)胞，替代、修復(fù)或加強(qiáng)受損的心肌組織的生物學(xué)功能

2、，引起了學(xué)者的高度重視，是近年來心血管病研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。本文擬將大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow-drived mesenchymal stem cells，MSCs)進(jìn)行分離、純化、擴(kuò)增、誘導(dǎo)成心肌樣細(xì)胞并進(jìn)行標(biāo)記，移植到同種異體大鼠的心肌梗死區(qū)，研究移植的MSCs對心臟功能的影響，闡述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞心臟移植對心肌梗死治療的可行性和有效性，并對細(xì)胞移植改善心功能的電生理學(xué)機(jī)制及其分子生物學(xué)基礎(chǔ)進(jìn)行探討。

3、 方法： 1、MSCs的分離、純化、擴(kuò)增和培養(yǎng)：無菌條件下采集大鼠雙側(cè)股骨、脛骨骨髓，用培養(yǎng)液沖至培養(yǎng)瓶中，通過及時、反復(fù)傳代對細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增純化。 2、MSCs向心肌樣細(xì)胞的誘導(dǎo)、鑒定及標(biāo)記：第3代細(xì)胞加入誘導(dǎo)劑5-氮胞苷(5-azacytidine，5-aza)5μmol/L，24h換液去除誘導(dǎo)劑，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞分化過程中的形態(tài)變化。應(yīng)用免疫組化法鑒定細(xì)胞肌動蛋白及肌鈣蛋白的表達(dá)，對分化形成的心肌樣

4、細(xì)胞進(jìn)行鑒定。用質(zhì)粒GFP轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記。3、大鼠心梗模型的建立及細(xì)胞移植：將大鼠用水合氯醛腹腔麻醉、氣管插管連接微型呼吸機(jī)進(jìn)行通氣。液氮冷凍大鼠左心室游離壁，制造心肌梗死模型。將30只大鼠隨機(jī)分為移植組和對照組，每組15只。心梗后立即進(jìn)行細(xì)胞移植。 4、心臟左室收縮功能檢測：手術(shù)前、細(xì)胞移植后1周、1個月分別應(yīng)用二維超聲心動圖(two dimensional echocardiography)測定兩組大鼠左室

5、射血分?jǐn)?shù)(1eft ventricular ejection fraction，INEF)。 5、通道蛋白及其基因表達(dá)檢測：用Western印跡分析及實時定量PCR技術(shù)對正常心肌細(xì)胞和誘導(dǎo)后細(xì)胞鉀離子和鈣離子通道蛋白及其基因的表達(dá)進(jìn)行定量分析，所測數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理后采用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以p<0.05為有顯著性差異。 結(jié)果： 1、MSCs的分離、純化、擴(kuò)增、培養(yǎng)及向心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)：MSCs經(jīng)分離、純化

6、、擴(kuò)增、培養(yǎng)后形態(tài)呈基本一致的梭形，加入誘導(dǎo)劑5一氮胞苷后經(jīng)免疫組化鑒定證實有肌動蛋白(actin)、心肌特異性肌鈣蛋白工(cardiac-specifictroponin I)的表達(dá)。 2、細(xì)胞的熒光標(biāo)記：質(zhì)粒GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞后熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞發(fā)綠色熒光，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，形態(tài)仍呈長梭形，與轉(zhuǎn)染前無明顯變化。 3、細(xì)胞移植對大鼠心臟左室收縮功能的影響：移植組細(xì)胞移植后一月，大鼠LVEF與心梗一周時相比未有明

7、顯惡化，與對照組相比有顯著性差異。 4、通道蛋白及其基因表達(dá)的定量分析：與正常心肌細(xì)胞相比，誘導(dǎo)后的MSCs部分鉀離子和鈣離子通道蛋白及其基因表達(dá)量均無顯著性差異。 結(jié)論： 1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)分離、純化、擴(kuò)增培養(yǎng)及5-氮胞苷誘導(dǎo)后，己具備心肌細(xì)胞的部分特點(diǎn)，表明在體外環(huán)境下可向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。 2、誘導(dǎo)后的細(xì)胞移植到心肌梗死區(qū)及其周圍后可改善心功能，證實骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植在治療心肌梗死中的可行性和