新型釀酒酵母整合載體的構(gòu)建及構(gòu)建方法研究.pdf

1、本研究主要探討一種酵母菌染色體定點整合載體的構(gòu)建方法及其實現(xiàn)染色體定點整合的可行性。參照SGD數(shù)據(jù)庫提供的酵母菌全基因組序列信息，選取4號染色體上基因HEM13上游-750--2150bp處無基因活性的DNA序列作為基因定點整合的靶位點。在這1400bp的DNA序列中選取毫不重合的兩部分，大小分別為744bp和602bp，作為整合載體的兩個同源臂hom1和hom2。載體pUC18-INT4是本研究需要構(gòu)建的目的載體，它的構(gòu)建基礎(chǔ)是本實驗

2、室已經(jīng)構(gòu)建的載體pUC18-RYUR。pUC18-INT4載體的構(gòu)建是將兩段同源臂hom1和hom2按照其在染色體上的位置和方向分別取代pUC18-RYUR上的兩段repeat序列。由此，構(gòu)建成了pUC18-INT4載體。
　　 本試驗使用酵母菌乙醇脫氫酶1(ADH1)基因作為驗證pUC18-INT4載體實現(xiàn)基因定點整合的驗證基因。用PCR方法擴增得到ADH1基因序列，利用限制性內(nèi)切酶位點，使其連接在pUC18-INT4載體上，

3、取代URA3序列，構(gòu)建成pUC18-INT4-A載體。pUC18-INT4載體實現(xiàn)基因定點整合需要兩個步驟，第一步：將pUC18-INT4載體轉(zhuǎn)化URA3序列缺失的酵母菌株，涂布于省卻尿嘧啶的培養(yǎng)基平板，利用選擇標(biāo)記基因URA3和PCR方法篩選出URA3序列正確整合的酵母菌株；第二步：將pUC18-INT4-A載體轉(zhuǎn)化在第一步中實現(xiàn)URA3序列正確整合的酵母菌株，利用URA3基因編碼的酶催化5-氟乳清酸(5-foa)產(chǎn)生細(xì)胞毒害物的特性